A BAHD-type acyltransferase concludes the biosynthetic pathway of non-bitter glycoalkaloids in ripe tomato fruit
- 作者
- Prashant D. Sonawane, Sachin A. Gharat, Adam Jozwiak, Ranjit Barbole, Sarah Heinicke, Efrat Almeekias-Siegl, Sagit Meir, Ilana Rogachev, Sarah E. O'Connor, Ashok P. Giri, Asaph Aharoni
- 杂志
- Nature Communications（2023）
- DOI
- 10.1038/s41467-023-40092-5
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
番茄成熟果实中苦味且有毒的α-番茄碱转化为非苦味低毒的Esculeoside A的生物合成途径中，关键的乙酰化步骤（hydroxytomatine转化为acetoxytomatine）所对应的酶长期未被鉴定，导致该途径核心步骤缺失。
研究策略
通过代谢物谱分析、转录组数据筛选、体外酶活测定、CRISPR-Cas9基因敲除、体外及本氏烟草体内重构等多种手段，从候选BAHD乙酰转移酶中鉴定出GAME36，并解析其在番茄糖生物碱解毒途径中的功能。
核心内容
番茄成熟果实中苦味且有毒的α-番茄碱需经多步修饰转化为非苦味低毒的Esculeoside A，其中关键的乙酰化步骤（hydroxytomatine转化为acetoxytomatine）所对应的酶长期未知。本研究通过代谢物谱分析、转录组筛选、体外酶活测定及CRISPR-Cas9基因敲除等手段，鉴定出编码BAHD型乙酰转移酶的基因GAME36（Solyc08g075210）。重组GAME36对底物hydroxytomatine的kcat/Km达250.52 min⁻¹ μM⁻¹，显著高于其他候选底物。在GAME36敲除的番茄突变体中，叶片和花中acetoxytomatine完全检测不到，而前体hydroxytomatine显著积累，证实其在体内催化该乙酰化步骤。进一步利用GAME31、GAME36、GAME40和GAME5四个酶，成功在体外及本氏烟草中重构了从α-番茄碱到Esculeoside A的完整生物合成途径。该发现补全了番茄糖生物碱解毒途径的核心酶学步骤，揭示了GAME36在番茄由苦味向甜味品种驯化中的潜在作用，也为利用合成生物学手段生产高价值甾体糖生物碱奠定了基础。
创新点
首次鉴定并功能验证了BAHD型乙酰转移酶GAME36，填补了番茄果实非苦味糖生物碱Esculeoside A生物合成途径中缺失的乙酰化步骤；利用四个酶实现了从α-番茄碱到Esculeoside A的体外和异源体内全途径重构；揭示了GAME36在番茄驯化和甜味品种演化中的潜在作用。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 番茄 (Solanum lycopersicum cv. Micro Tom) | 甾体糖生物碱 (SGA) / Esculeoside A 生物合成途径 | Solyc08g075210 (GAME36) | GAME36 | 催化 | BAHD型乙酰转移酶，催化羟基化SGA（如hydroxytomatine）的乙酰化反应，生成acetoxytomatine |
| 番茄 (Solanum lycopersicum cv. Micro Tom) | SGA / Esculeoside A 生物合成途径 | GAME31 | GAME31 | 催化 | 2-酮戊二酸依赖性双加氧酶 (2-ODD)，催化α-番茄碱C-23羟基化生成hydroxytomatine |
| 番茄 (Solanum lycopersicum cv. Micro Tom) | SGA / Esculeoside A 生物合成途径 | GAME40 | GAME40 | 催化 | 2-ODD，催化acetoxytomatine C-27羟基化生成acetoxy-hydroxytomatine |
| 番茄 (Solanum lycopersicum cv. Micro Tom) | SGA / Esculeoside A 生物合成途径 | GAME5 | GAME5 | 催化 | UDP-糖基转移酶 (UGT)，催化acetoxy-hydroxytomatine 27-O-葡萄糖基化生成Esculeoside A |
| 番茄 (Solanum lycopersicum) | SGA 转运 | GORKY | GORKY | 转运 | 硝酸盐/肽家族转运蛋白，将α-番茄碱从液泡转运至细胞质供下游酶代谢 |
| 野生番茄 (Solanum pennellii LA0716) | SGA / Esculeoside A 生物合成途径 | SpGAME36 (Sopen08g023820) | SpGAME36 | 催化 | 与SIGAME36有99%氨基酸同一性，同样具有乙酰转移酶活性 |
| 大肠杆菌 (E. coli) | Esculeoside A 体外重构 | GAME36 | GAME36 | 催化 | 重组SIGAME36用于体外酶学表征和途径重构 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | Esculeoside A 异源体内重构 | GAME31, GAME36, GAME40, GAME5 | GAME31, GAME36, GAME40, GAME5 | 催化 | 瞬时共表达四个GAME酶并外源添加α-番茄碱，成功生成Esculeoside A |
关键发现
- GAME36（Solyc08g075210）编码BAHD型乙酰转移酶，催化hydroxytomatine（m/z
- 50）乙酰化生成acetoxytomatine（m/z
- 54）；重组SIGAME36对hydroxytomatine的kcat/Km为250.52 min^-1 μM^-1，对hydroxyosalmargine为41.22 min^-1 μM^-1；对乙酰CoA的kcat/Km为108.23 min^-1 μM^-1，对丁酰CoA为40.91 min^-1 μM^-1；CRISPR-Cas9敲除GAME36的番茄突变体中，叶片和花中acetoxytomatine和acetoxydehydrotomatine完全检测不到，而前体hydroxytomatine和hydroxydehydrotomatine显著积累；体外四酶（GAME31、GAME36、GAME40、GAME5）重构可产生Esculeoside A及其所有途径中间体；在本氏烟草中瞬时共表达这四个酶并补充α-番茄碱同样生成Esculeoside A。
研究结论
GAME36是番茄果实中非苦味低毒糖生物碱生物合成途径的关键乙酰转移酶，它的发现补全了Esculeoside A途径的核心酶学步骤，并表明该酶在番茄由苦味向甜味品种驯化过程中发挥重要作用，同时为利用代谢工程和合成生物学手段生产高价值甾体糖生物碱奠定了基础。