Molecular insights into the catalytic promiscuity of a bacterial diterpene synthase
- 作者
- Zhong Li, Lilan Zhang, Kangwei Xu, Yuanyuan Jiang, Jieke Du, Xingwang Zhang, Ling-Hong Meng, Qile Wu, Lei Du, Xiaoju Li, Yuechan Hu, Zhenzhen Xie, Xukai Jiang, Ya-Jie Tang, Ruibo Wu, Rey-Ting Guo, Shengying Li
- 单位
- State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University; Shandong University; Guangzhou Laboratory; Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences; University of Chinese Academy of Sciences; School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-sen University
- 杂志
- Nature Communications（2023）
- DOI
- 10.1038/s41467-023-39706-9
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
解析细菌二萜合酶VenA的底物混杂性和独特5-5-6-7四环骨架环化机制的结构基础，并探索其底物特异性的理性改造。
研究策略
通过解析VenA的apo和holo晶体结构（与三核镁簇和焦磷酸基团复合），结合底物对接、分子动力学（MD）模拟、QM/MM计算、定点突变、产物分离与结构鉴定，以及半理性工程改造。
核心内容
该研究通过解析细菌二萜合酶VenA的apo（2.03 Å）和holo（2.18 Å）晶体结构，结合底物对接、分子动力学模拟、QM/MM计算及定点突变，系统揭示了其催化混杂性和独特5-5-6-7四环骨架形成的分子机制。结构分析发现，非典型Asp-rich基序（DSFVSVD）中Ser116和Gln83替代了保守的第二个天冬氨酸，与NSE基序共同配位三核镁簇。QM/MM计算表明GGPP的焦磷酸裂解能垒为25.4 kcal/mol，而1,10-环化过程无势垒且放热4.0 kcal/mol，阐明了环化起始的关键步骤。通过半理性工程改造，单突变体VenA^W107A在摇瓶发酵中产量达275.5±9.4 mg/L，六突变体则成功将底物谱扩展至GFPP，使92.6%的产物转化为14元大环二倍半萜，活性位点体积从516.1 Å^3扩大至641.5 Å^3。该工作首次报道了介导GGPP 1,10-环化的二萜合酶结构，提出了一类新的I型微生物萜类合酶亚类，并通过结构指导的工程改造成功将二萜合酶转化为二倍半萜合酶，为理解萜类合酶的底物特异性和催化混杂性提供了重要理论基础，也为萜类化合物的多样性创制开辟了新途径。
创新点
首次解析了介导GGPP 1,10-环化的二萜合酶晶体结构；鉴定并验证了非典型Asp-rich基序（DSFVSVD）中Ser116和Gln83替代第二个天冬氨酸的功能；通过生物信息学发现了一类新的I型微生物萜类合酶亚类；基于结构信息将VenA半理性工程化为二倍半萜合酶。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 萜类生物合成 | venA | VenA | 催化 | 用于异源表达和酶活性分析，催化GGPP/FPP/GPP环化 |
| Streptomyces venezuelae ATCC 15439 | 二萜生物合成 | venA | VenA | 催化 | 来源菌株，VenA负责合成venezuelane A（5-5-6-7四环骨架） |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 二萜生物合成（GGPP供给） | venD | VenD | 催化 | 与VenA突变体共表达以过量生产GGPP |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 萜类生物合成 | venA（Y88A/W107A/V111A/T112A/F215A/F219A） | VenA hexamutant | 催化 | 半理性工程改造的二倍半萜合酶，可接受GFPP生成19 |
关键发现
- VenA apo结构分辨率2.03 Å（PDB 7Y9H），holo结构分辨率2.18 Å（PDB 7Y9G）
- 三核镁簇由非典型115DSFVSVD120基序和NSE基序配位。QM/MM计算表明GGPP的PPi裂解能垒为25.4 kcal/mol，1,10-环化无势垒（放热4.0 kcal/mol）
- FPP和GPP的PPi裂解能垒分别为24.9和24.8 kcal/mol。VenA^R221K对GGPP和FPP活性分别下降49.8%和36.4%
- VenA^Y345F保留23.4%（GGPP）和50.8%（FPP）活性
- VenA^S116A对GGPP和FPP活性分别下降29.9%和71.5%
- VenA^Y88A对GGPP活性下降78.3%，主要产生β-springene（7）和stembene A（8）
- VenA^W107A产生doleballatriene（9），摇瓶发酵产量达275.5±9.4 mg/L
- VenA^F185A产生venezuelaenol A（11）和venezuelaenol B（12），并保留25.8%产物为1。六突变体VenA^Y88A/W107A/V111A/T112A/F215A/F219A能接受GFPP，将92.6%的产物转化为14元大环二倍半萜19，活性位点体积从516.1 Å^3扩大至641.5 Å^3。
研究结论
VenA的结构和机理研究揭示了非典型Asp-rich基序中Ser116和Gln83对催化功能的关键替代作用，提出了一类新的I型微生物TPS亚类；通过QM/MM和突变分析阐明了1,10-环化和后续四元环/质子化环丙烷中间体的新机制；并通过结构指导的半理性工程成功将二萜合酶VenA改造为二倍半萜合酶，为萜类合酶底物特异性和催化混杂性的理解与工程改造提供了重要基础。