Reconstitution of early paclitaxel biosynthetic network
- 作者
- Jack Chun-Ting Liu, Ricardo De La Peña, Christian Tocol, Elizabeth S. Sattely
- 杂志
- Nature Communications（2024）
- DOI
- 10.1038/s41467-024-45574-8
- 所属领域
- 合成生物学 / 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
紫杉醇生物合成早期途径重构的瓶颈：细胞色素P450酶T5αH异源表达时催化混杂产生多种副产物，导致目标产物taxadien-5α-ol产量低且难以表征下游途径。
研究策略
结构表征T5αH的产物，提出过表达导致过度氧化；通过使用弱启动子（UBQ10、NOS）降低T5αH表达水平，减少副产物，提高taxadien-5α-ol积累，并重构六个Taxus酶参与的早期紫杉醇生物合成网络。
核心内容
该研究针对紫杉醇生物合成早期途径重构中细胞色素P450酶T5αH异源表达催化混杂的问题展开。作者首先对T5αH在植物中的氧化产物进行了结构鉴定，新发现了四个氧化产物，并揭示过表达T5αH会导致底物发生过度氧化。为缓解这一问题，研究采用弱启动子UBQ10和NOS替代强启动子35S来降低T5αH的表达水平，使taxadien-5α-ol的绝对产量提高了3倍，多氧化产物比例从68%降至25%。在此基础上，研究成功在本氏烟草中重构了包含TS、T5αH、TAT、T10βH、DBAT和T13αH六个Taxus酶的早期生物合成网络，纯化并鉴定了终产物14，其产量达到63 μg/g DW。该工作证明通过精细调控P450酶表达水平可有效抑制副反应，所建立的多基因重构平台为发现紫杉醇生物合成途径中剩余的未知基因提供了可用的研究体系。
创新点
1. 首次结构鉴定T5αH的四个新氧化产物（5-8）；2. 证明T5αH过表达导致底物过度氧化；3. 利用NOS启动子降低T5αH表达，使taxadien-5α-ol产量提高3倍，多氧化产物比例从68%降至25%；4. 成功重构包含TS、T5αH、TAT、T10βH、DBAT和T13αH的六步早期紫杉醇生物合成网络，并纯化鉴定终产物14。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 本氏烟草（Nicotiana benthamiana）；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 紫杉醇生物合成途径 | TS | taxadiene synthase | 催化 | 二萜环化酶，催化GGPP转化为taxadiene（1）；在本氏烟草中以胞质定位形式（cytoTS）表达，在酵母中用于生产taxadiene。 |
| 本氏烟草；酿酒酵母 | 紫杉醇生物合成途径 | T5αH | taxadiene 5α-hydroxylase | 催化 | 细胞色素P450，催化taxadiene（1）羟基化为taxadien-5α-ol（2）；异源表达时催化混杂，过表达导致过度氧化形成副产物。 |
| 本氏烟草 | 紫杉醇生物合成途径 | TAT | taxadien-5α-ol O-acetyltransferase | 催化 | 乙酰转移酶，催化taxadien-5α-ol（2）乙酰化为5α-acetoxytaxadiene（11）。 |
| 本氏烟草 | 紫杉醇生物合成途径 | T10βH | taxane 10β-hydroxylase | 催化 | 细胞色素P450，催化5α-acetoxytaxadiene（11）羟基化为5α-acetoxytaxadien-10β-ol（12）。 |
| 本氏烟草 | 紫杉醇生物合成途径 | DBAT | 10-deacetylbaccatin III:10-O-acetyltransferase | 催化 | 乙酰转移酶，催化5α-acetoxytaxadien-10β-ol（12）乙酰化为5α,10β-diacetoxytaxadiene（13）。 |
| 本氏烟草 | 紫杉醇生物合成途径 | T13αH | taxane 13α-hydroxylase | 催化 | 细胞色素P450，催化taxadien-5α-ol（2）羟基化为taxadien-5α,13α-diol（16），或催化13羟基化生成14。 |
| 本氏烟草 | 甲羟戊酸途径 | tHMGR | 截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 截短HMGR，增强甲羟戊酸途径通量，提高异戊二烯前体供给。 |
| 本氏烟草 | 二萜前体生物合成 | GGPPS | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 | 催化 | 催化GGPP合成，增强二萜前体供应。 |
| 本氏烟草 | 紫杉醇生物合成途径 | TAX19 | taxadien-5α-ol O-acetyltransferase同源物 | 催化 | TAT同源乙酰转移酶，用于将化合物6和7转化为乙酰化形式以进行结构表征。 |
关键发现
- 使用NOS启动子后taxadien-5α-ol绝对产量提高3倍
- 多官能团化产物比例从68%（35S）降至37%（UBQ10）和25%（NOS）
- 聚氧化产物减少
- 重构六步途径后终产物14产量为63 μg/g DW，副产物15为42 μg/g DW
- T5αH表达产生至少36种氧化产物（N. benthamiana）和21种（S. cerevisiae）
- 化合物5-8的结构被解析
- T5αH直接氧化2形成9。
研究结论
通过降低T5αH表达水平缓解其过度氧化，成功重构了早期紫杉醇生物合成网络，证明六个Taxus基因可协同产生关键中间体，为发现剩余紫杉醇生物合成基因提供了平台。