Systematic biotechnological production of isoprenoid analogs with bespoke carbon skeletons
- 作者
- Lina Wang, Mads Rosenfeldt, Aikaterini Koutsaviti, Maria Harizani, Yong Zhao, Nattawat Leelahakorn, Axelle Frachon, Morten H. Raadam, Karel Miettinen, Irini Pateraki, Efstathia Ioannou, Sotirios C. Kampranis
- 杂志
- Nature Communications（2025）
- DOI
- 10.1038/s41467-025-57494-2
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
异戊二烯规则使所有天然萜类均由C5前体DMAPP和IPP构建，难以系统合成具有额外碳原子或非天然碳骨架的萜类类似物；化学合成因萜类结构复杂、多手性中心而效率低且成本高。
研究策略
在酿酒酵母中建立异戊烯醇利用通路：利用拟南芥法尼醇激酶AtFKI和异戊烯基磷酸激酶AtPK，将异戊烯醇类C6/C7醇磷酸化为非经典DMAPP/IPP类似物，再经工程化的异戊烯基转移酶和萜类合酶将其整合到单萜、倍半萜、三萜和大麻素类似物中。
核心内容
针对天然萜类受异戊二烯规则限制、难以获得非天然碳骨架的问题，该研究在酿酒酵母中建立了一套可系统扩展萜类化学空间的异戊烯醇利用通路。通过拟南芥来源的截短型法尼醇激酶Δ65AtFKI和异戊烯基磷酸激酶AtPK，将外源供给的C6/C7异戊烯醇类似物磷酸化为非经典DMAPP/IPP前体，再经工程化的异戊烯基转移酶与萜类合酶整合，成功实现了C11/C12单萜、C16/C17倍半萜、C31三萜以及多种大麻素类似物的定向生物合成。实验表明，截短型激酶转化效率较全长提高3.72倍，7种异戊烯醇类似物均被接受，其中异戊烯醇型醇掺入效率达62.1%–95.6%。以(E)-3M2E为底物时，(E)-乙基芳樟醇产量达21.94 mg/L，转化率51.5%，且产物近乎纯(E)型。合成的新型CBGA类似物中，化合物17对CB2受体的激活活性较CBGA提高9.6倍，其热脱羧产物对CBG亦有最高24.4倍增强。该策略提供了无需化学合成即可系统性扩展萜类骨架的通用平台，可直接适配于现有萜类细胞工厂，为创制高价值萜类类似物提供了可行路径。
创新点
建立了可绕过C5前体限制的系统化异戊烯醇利用通路；鉴定并优化了AtFKI/AtPK激酶组合，截短型Δ65AtFKI效率提高3.72倍；实现了C11/C12单萜、C16/C17倍半萜、C31三萜以及多种CBGA类似物的定向生物合成；首次实现乙基芳樟醇的微生物生物合成并获得几乎纯(E)型产物；合成的新型CBGA/CBG类似物对CB2受体激活活性显著增强。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，EGY48株） | 异戊烯醇利用通路 | AtFKI | 拟南芥法尼醇激酶（AtFKI） | 催化 | 将异戊烯醇类醇磷酸化为相应的异戊烯基单磷酸（第一步） |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，EGY48株） | 异戊烯醇利用通路 | AtPK | 拟南芥异戊烯基磷酸激酶（AtIPK/AtPK） | 催化 | 将异戊烯基单磷酸磷酸化为非经典DMAPP/IPP类似物（第二步） |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 甲羟戊酸途径/萜类前体合成 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶（Erg20p） | 催化 | 将非经典DMAPP/IPP类似物与内源IPP/DMAPP缩合生成GPP/FPP类似物 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 萜类前体合成 | ERG20(F96C) | Erg20p(F96C)突变体 | 催化 | 作为GPP合酶用于高效合成C16/C17异戊烯基二磷酸类似物 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 萜类前体合成 | ERG20(N127W) | Erg20p(N127W)突变体 | 催化 | 作为GPP合酶用于乙基芳樟醇及CBGA类似物的前体合成 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 三萜生物合成 | ERG9 | 角鲨烯合酶（Erg9p） | 催化 | 将非经典FPP类似物转化为26-甲基角鲨烯 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 单萜生物合成 | CILims | 柠檬烯合酶（CILims） | 催化 | 利用C11/C12 GPP类似物产生柠檬烯类似物1和2 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 单萜生物合成 | McLinS | 芳樟醇合酶（McLinS） | 催化 | 利用8-甲基-GPP等非经典前体产生乙基芳樟醇及芳樟醇类似物 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 倍半萜生物合成 | SfCarS1 | 反式-β-石竹烯合酶（SfCarS1） | 催化 | 利用C16/C17 FPP类似物产生倍半萜类似物3–5 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 倍半萜生物合成 | Cyc2 | terpentetriene合酶（Cyc2） | 催化 | 用于检测非经典C16/C17倍半萜产物 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 大麻素生物合成 | CsPT4 | 大麻萜酚酸合酶/香叶基转移酶（CsPT4） | 催化 | 缩合橄榄醇酸（OA）与GPP类似物生成CBGA类似物12–18 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 异戊烯醇利用通路 | AtFKI（截短型Δ65） | Δ65AtFKI | 催化 | 去除N端转运肽，转化效率较全长酶提高3.72倍 |
关键发现
- 截短型Δ65AtFKI比全长AtFKI转化异戊烯醇的效率高3.72倍。7种异戊烯醇类似物被接受，异戊烯醇型醇掺入效率为62.1%–95.6%，异戊烯醇型（isoprenol-like）为20.6%–44.7%。成功合成C11/C12柠檬烯类似物、C16/C17倍半萜类似物和C31的26-甲基角鲨烯。以0.003% (v/v) (E)-3M2E为底物时，(E)-3M2E转化为(E)-乙基芳樟醇的转化率为51.5±1.7%，产量为21.94±0.73 mg/L。CBGA类似物12–18均为新化合物
- 其中化合物17在10^-3 M浓度下对CB2的激活比CBGA提高9.6倍，化合物12和13分别提高8倍和7倍
- 热脱羧所得CBG类似物中，12、13和17在3×10^-3 M下较CBG分别提高18.4倍、19.1倍和24.4倍。
研究结论
该酵母全细胞生物催化方法简单、可推广且可扩展，能够通过供给不同的异戊烯醇类似物系统性地扩展萜类化学空间，定向生产具有额外碳原子或改进性能的高价值萜类类似物，并可适配到已有原核或真核萜类细胞工厂中。