Regiodivergent biosynthesis of bridged bicyclononanes
- 作者
- Lukas Ernst, Hui Lyu, Pi Liu, Christian Paetz, Hesham M. B. Sayed, Tomke Meents, Hongwu Ma, Ludger Beerhues, Islam El-Awaad, Benye Liu
- 杂志
- Nature Communications（2024）
- DOI
- 10.1038/s41467-024-48879-w
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
植物中多环聚异戊二烯酰基间苯三酚（PPAPs）的桥环双环[3.3.1]壬烷骨架的生物合成机制长期不明，尤其是催化形成A型和B型双环骨架的关键酶尚未被发现。
研究策略
利用H. sampsonii转录组筛选含有特殊杂合天冬氨酸富集基序的候选异戊烯基转移酶（PT），通过酿酒酵母异源表达和酶活测定鉴定功能，结合AlphaFold2建模、分子对接和定点突变研究区域发散性机制，并在本氏烟草中验证体内活性，进一步利用序列信息在贯叶金丝桃中鉴定同源酶。
核心内容
该研究从元宝草转录组中筛选出两个含有特殊杂合天冬氨酸富集基序的双功能异戊烯基转移酶HscPTa和HscPTb。通过酿酒酵母异源表达和酶活测定，证实二者均能以同一底物grandone 1为底物进行区域发散性异戊烯基环化，分别生成A型双环产物7-epi-nemorosone（3）和B型双环产物7-epi-clusianone（5）；HscPTa还能将kolanone 2转化为新化合物nemosampone（4）。动力学分析显示HscPTa对底物1的KM为62.01 μM，HscPTb对其KM为40.36 μM。通过AlphaFold2建模与分子对接，揭示了倒置底物结合模式是决定区域选择性的关键机制。定点突变实验表明F111C单点突变即可完全消除区域选择性，而九点组合突变成功将A型环化酶HscPTa完全转变为B型环化酶。此外，从贯叶金丝桃中鉴定到同源酶HpCPTa1（序列一致性64.5%），可催化colupolone生成hyperforin前体的内外型差向异构体。该研究阐明了植物PPAP桥环骨架区域发散性生物合成的分子机制，为通过合成生物学可持续生产这类药用复杂化合物提供了关键酶元件。
创新点
['首次发现两个双功能PT酶HscPTa和HscPTb，可催化同一底物发生区域发散性异戊烯基环化，分别生成A型和B型PPAP双环骨架', '通过分子对接揭示倒置底物结合模式是决定区域选择性的关键机制', '通过九点突变成功将A型环化酶HscPTa转换为B型环化酶', '从贯叶金丝桃中鉴定出HpCPTa1，可催化形成hyperforin和secohyperforin', '发现了自然界首个具有PHB/HG杂合天冬氨酸富集基序的植物PT']
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | PPAPs生物合成通路 | HscPTa | HsCPTa | 催化 | 双功能异戊烯基转移酶，催化异戊烯基环化生成A型产物7-epi-nemorosone，也能转化kolanone 2生成nemosampone |
| Saccharomyces cerevisiae | PPAPs生物合成通路 | HscPTb | HsCPTb | 催化 | 双功能异戊烯基转移酶，催化同一底物生成B型产物7-epi-clusianone，对kolanone 2无活性 |
| Nicotiana benthamiana | PPAPs生物合成通路 | HscPTa | HsCPTa | 催化 | 在本氏烟草叶片中瞬时表达后，孵育底物1可生成A型产物3 |
| Nicotiana benthamiana | PPAPs生物合成通路 | HscPTb | HsCPTb | 催化 | 在本氏烟草叶片中瞬时表达后，孵育底物1可生成B型产物5 |
| Saccharomyces cerevisiae | hyperforin生物合成通路 | HpCPTa1 | HpCPTa1 | 催化 | 来自Hypericum perforatum的同源酶，催化colupolone生成secohyperforin（外型）或hyperforin，与HscPTa活性互补 |
| Saccharomyces cerevisiae | PPAPs生物合成通路 | HscPTa突变体 | 突变体HsCPTa | 催化 | 通过F111C等九点突变将A型区域选择性转换为B型，证明关键氨基酸控制底物结合方向 |
| Hypericum sampsonii | PPAPs生物合成通路 | HscPTa, HscPTb | HsCPTa, HsCPTb | 催化 | 内源酶，定位于叶绿体被膜，分别负责A型和B型PPAP的体内生成 |
关键发现
- HscPTa对底物grandone 1的KM为62.01±10.06 μM，对DMAPP的KM为65.44±6.63 μM，对kolanone 2的KM为114.24±20.03 μM
- HscPTb对1的KM为40.36±5.06 μM，对DMAPP的KM为297.79±29.49 μM。HscPTa和HscPTb分别生成7-epi-nemorosone (3)和7-epi-clusianone (5)，且HscPTa还能将kolanone 2转化为新化合物nemosampone (4)。产物旋光度[α]D分别为+82.4 (3)、+110.3 (4)、+46.7 (5)。F111C单点突变完全消除HscPTa的区域选择性
- 通过Y107F、T112S、Q115H、N153H、M149V、I156M、E161D、V167I等组合的九重突变将HscPTa转化为B型环化酶。HpCPTa1与HscPTa氨基酸序列一致性为64.5%，可催化colupolone分别生成secohyperforin内型和外型差向异构体，HscPTa对colupolone的KM为105.55±9.86 μM。
研究结论
研究阐明了植物中生成A型和B型双环[3.3.1]壬烷PPAP骨架的区域发散性生物合成机制，鉴定了关键酶HscPTa和HscPTb及其倒置底物结合模式，并通过突变实现了区域选择性的互换。该发现为通过合成生物学方法可持续生产这些具有药用价值的复杂化合物提供了关键酶元件和序列信息。