Structure of bifunctional variediene synthase yields unique insight on biosynthetic diterpene assembly and cyclization
- 作者
- Eliott S. Wenger, David W. Christianson
- 杂志
- Nature Communications（2025）
- DOI
- 10.1038/s41467-025-60537-3
- 所属领域
- 结构生物学/酶学
- 关键词
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解决的核心问题
解析双功能萜烯合酶的完整三维结构，阐明异戊二烯基转移酶与环化酶之间的底物转运（channeling）机制，并探索该类酶在真菌及动物中的分布与进化。
研究策略
利用冷冻电镜（cryo-EM）解析来自Emericella variecolor的variediene synthase（EvVS）全酶结构，结合稳态动力学、底物竞争实验、AlphaFold3结构预测和序列相似性网络分析，揭示域间相互作用及底物通道模式。
核心内容
该研究通过冷冻电镜解析了Emericella variecolor来源的双功能二萜合酶EvVS的495-kD全酶结构，首次展示了异戊二烯基转移酶六聚体核心被两个环化酶三聚体夹在中间的bollard-like组装模式，核心与环化酶区域分辨率分别达2.77 Å和2.98–3.59 Å。动力学与底物竞争实验表明，GGPP并不在EvVS内部进行分子内通道，而是被释放至溶液后与环化酶结合；但EvVS与外源环化酶PaFS_Cy混合时，以DMAPP/IPP为底物时产物比variediene:fusicoccadiene由1:1.1变为1:5.4，提示GGPP可从异戊二烯基转移酶优先传递至非天然环化酶，发生分子间通道。环化酶域单独表达时kcat较全长酶降低约50%，表明域间相互作用虽不介导底物通道，但对催化活性有贡献。序列相似性网络共鉴定1016条双功能萜烯合酶，其中在蛭形轮虫Adineta steineri中首次发现此类酶，拓展了其系统分布。AlphaFold3预测的ipTM分数与实验观察的域间稳定性一致。该工作揭示了双功能萜烯合酶碳流管理的独特机制，为工程改造二萜生物合成效率提供了结构基础。
创新点
['首次解析了完整的双功能萜烯合酶全酶结构，所有催化域均可见：六聚体异戊二烯基转移酶核心夹在两个环化酶三聚体之间，形成bollard-like组装。', '发现EvVS中GGPP不发生分子内通道，而是被释放至溶液后再结合环化酶；但意外地观察到GGPP优先传递至非天然环化酶PaFS_Cy，即分子间通道。', '在动物（蛭形轮虫Adineta steineri）中首次发现双功能萜烯合酶序列。', '通过AlphaFold3预测和ipTM评分，建立了预测双功能萜烯合酶域间相互作用稳定性的方法。']
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| — | 二萜生物合成 | — | Variediene synthase (EvVS) | 催化 | 来自Emericella variecolor的双功能萜烯合酶，含异戊二烯基转移酶域和I类环化酶域，催化GGPP环化生成variediene。 |
| — | 二萜生物合成 | — | EvVS异戊二烯基转移酶域 | 催化 | 六聚体核心，催化DMAPP与3分子IPP缩合生成GGPP。 |
| — | 二萜生物合成 | — | EvVS环化酶域 | 催化 | 催化GGPP环化生成variediene，单独表达时kcat约为全长酶的50%。 |
| — | 二萜生物合成 | — | PaFS_Cy (fusicoccadiene synthase cyclase domain) | 催化 | 来自Phomopsis amygdala的fusicoccadiene合酶环化酶域，在竞争实验中接受来自EvVS异戊二烯基转移酶的GGPP，实现分子间通道。 |
| — | 二萜生物合成 | — | CotB2 (cyclooctathenol synthase) | 催化 | 竞争实验中使用的环化酶，用于检测EvVS底物通道。 |
| — | 二萜生物合成 | — | SpS (spatadiene synthase) | 催化 | 竞争实验中使用的环化酶，用于检测EvVS底物通道。 |
关键发现
['EvVS是一个495-kD的双功能萜烯合酶，cryo-EM结构显示其六聚体异戊二烯基转移酶核心被两个环化酶三聚体夹在中间。', '六聚体核心结构分辨率为2.77 Å，六环化酶结构为3.18 Å（C3对称化后），五环化酶结构为3.59 Å，最优单环化酶结构（Map 3）分辨率达2.98 Å。', '底物竞争实验表明，EvVS与CotB2等摩尔混合时，以GGPP为底物产物比variediene:cyclooctathenol为1:1.1，以DMAPP/IPP为底物时为1:0.8，变化不显著，不支持分子内通道。', 'EvVS与PaFS_Cy等摩尔混合时，以GGPP为底物产物比variediene:fusicoccadiene为1:1.1，而以DMAPP/IPP为底物时变为1:5.4，表明GGPP优先从EvVS的异戊二烯基转移酶传递至非天然环化酶PaFS_Cy。', 'EvVS环化酶域单独表达时，kcat比全长酶降低约50%。', "环化酶-异戊二烯基转移酶界面埋藏表面积为1228 Ų，主要靠螺旋间'knobs-into-holes'堆积和疏水效应驱动。", '序列相似性网络共鉴定1016条双功能萜烯合酶序列，含60个至少3条序列的簇，其中21条来自淡水蛭形轮虫Adineta steineri。', 'AlphaFold3预测中，EvVS的ipTM分数最高（0.69），PaFS最低（0.43），与实验观察的域间相互作用稳定性一致。']
研究结论
EvVS的完整结构揭示了双功能萜烯合酶中异戊二烯基转移酶与环化酶以domain-swapped方式组装，但底物GGPP并不进行分子内通道；相反，GGPP被释放后可与外源环化酶发生分子间通道。该研究增进了对真菌及动物中双功能萜烯合酶碳流管理机制的理解，并为蛋白工程优化生物合成效率提供指导。