Fast growth and high-titer bioproduction from renewable formate via metal-dependent formate dehydrogenase in Escherichia coli
- 作者
- Aidan E. Cowan, Mason Hillers, Vittorio Rainaldi, Florent Collas, Hemant Choudhary, Basem S. Zakaria, Gregory G. Bieberach, David N. Carruthers, Maxwell Grabovac, Jennifer W. Gin, Bridgie Cawthon, Yan Chen, Emine Akyuz Turumtay, Edward E. K. Baidoo, Christopher J. Petzold, Adam M. Feist, Sara Tejedor-Sanz, Frank Kensy, Blake A. Simmons, Jay D. Keasling, Nico J. Claassens
- 杂志
- Nature Communications（2025）
- DOI
- 10.1038/s41467-025-61001-y
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
人工合成甲酸营养型菌株生长缓慢且产率低，主要原因是异源甲酸脱氢酶（FDH）活性慢，导致能量供应不足，无法达到天然甲酸营养菌的生长速度和工业化要求的产物产量。
研究策略
用来自Cupriavidus necator的金属依赖型、多亚基甲酸脱氢酶（cnFDH）替换原有的金属非依赖型psFDH，结合还原性甘氨酸途径（rGlyP）和短期适应性实验室进化（ALE），优化FDH表达和全局转录，获得快速生长的甲酸营养型大肠杆菌，用于产甲羟戊酸和异戊烯醇；并集成电化学CO2还原和木质素氧化降解产生甲酸盐的路线。
核心内容
针对人工甲酸营养型菌株生长缓慢、产物产量低的问题，该研究将大肠杆菌中原本效率低下的金属非依赖型甲酸脱氢酶（psFDH）替换为来源于贪铜菌的金属依赖型多亚基酶（cnFDH），并结合还原性甘氨酸途径与约25代的短期适应性实验室进化，系统优化了酶表达和全局转录。改造后的K4Me2菌株在100 mM甲酸中最小倍增时间仅为4.4±0.1小时，生物量产率提升至3.3±0.1 gDCW/mol甲酸，优于原始菌株的2.3。在分批补料发酵中，工程菌产甲羟戊酸达3.8 g/L，为目前以甲酸为唯一碳源报道的最高值；同时实现了从电化学CO₂还原产生的甲酸盐和木质素衍生甲酸盐混合物合成甲羟戊酸（分别达22.8和32.0 mg/L）及异戊烯醇。值得注意的是，cnFDH仅占蛋白组约0.2%即达到远超psFDH的催化效率，而后者需过量表达至20%以上。该工作证明通过关键酶替换与定向进化，可大幅提升合成甲酸营养菌的生长和产能，为可持续甲酸生物经济及与电化学、木质素解聚工艺耦合提供了技术可行性。
创新点
['首次在大肠杆菌中功能性表达金属依赖型甲酸脱氢酶cnFDH，其仅占蛋白组约0.2%，催化效率比psFDH高一个数量级', '通过约25代的短期适应性进化获得倍增时间约4.5小时的甲酸营养型大肠杆菌，接近天然最快速率', '从甲酸为唯一碳源实现3.8 g/L甲羟戊酸，为目前最高报道值', '展示了从电化学CO2还原产生的甲酸盐（e-formate）和木质素氧化降解的甲酸-rich混合物生产甲羟戊酸和异戊烯醇的可行性']
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli (K4e) | 还原性甘氨酸途径 (rGlyP) | psFDH | psFDH (甲酸脱氢酶) | 催化 | 原始菌株中的金属非依赖型甲酸脱氢酶，kcat约10 s^-1，后替换为cnFDH |
| Escherichia coli (K4M/K4Me2) | 还原性甘氨酸途径 (rGlyP) | fdsGBACD | cnFDH (甲酸脱氢酶复合物) | 催化 | 来自Cupriavidus necator的金属依赖型甲酸脱氢酶，kcat>100 s^-1，仅占蛋白组约0.2% |
| Escherichia coli (K4Me2_mev) | 甲羟戊酸生物合成途径 | atoB, HMGS, HMGR | AtoB, HMGS, HMGR | 催化 | 催化乙酰-CoA转化为甲羟戊酸 |
| Escherichia coli (K4Me2_isop) | IPP旁路途径 | PMD (R74G), mevalonate kinase | 突变型磷酸甲羟戊酸脱羧酶、甲羟戊酸激酶 | 催化 | 用于从甲羟戊酸生产异戊烯醇 |
| Escherichia coli (BW25113 Δlpd) | NADH再生 | lpd | Lpd (硫辛酰胺脱氢酶) | 催化 | 敲除lpd构建能量营养缺陷菌，用于评估FDH体内活性 |
| Escherichia coli (K4Me1-3) | 全局转录调控 | rpoC | RNA聚合酶β'亚基 | 调控 | 适应性进化中出现的突变，影响全局转录，可能促进在甲酸培养基中的生长 |
| Escherichia coli (K4M+) | 基因表达调控 | lac operator (lacO) | LacI结合位点 | 调控 | 突变导致在无IPTG时cnFDH表达去抑制并上调，优化酶表达水平 |
关键发现
- K4Me2菌株在100 mM甲酸中的最小倍增时间为4.4±0.1小时，优于原始K4e（>6小时）
- 生物量产率为3.3±0.1 gDCW/mol甲酸（K4e为2.3±0.1）
- fed-batch条件下K4Me2_mev达到3.3和3.8 g/L甲羟戊酸，而K4e仅1.3和1.2 g/L
- 小规模混合营养生产中K4Me2_mev产生86.8±7.3 mg/L甲羟戊酸（K4e为37.5±8.8 mg/L）
- 从电化学甲酸盐产生22.8±3.0 mg/L甲羟戊酸和11.9±5.1 mg/L异戊烯醇
- 从木质素衍生甲酸盐混合物产生32.0±5.8 mg/L甲羟戊酸
- cnFDH在能量缺陷菌中占0.2%蛋白组，而psFDH超过20%。
研究结论
通过替换为金属依赖型甲酸脱氢酶并进行短期适应性进化，成功构建了快速生长（倍增时间≈4.5小时）的合成甲酸营养型大肠杆菌，可实现从甲酸原料高效生产甲羟戊酸（3.8 g/L）等产品，并可与电化学CO2还原和木质素氧化降解相结合，证明可持续甲酸生物经济在技术和经济上具有可行性。