Flux- Enabled Exploration of the Role of Sip1 in Galactose Yeast Metabolism
- 作者
- Christopher M. Shymansky, George Wang, Edward E. K. Baidoo, Jennifer Gin, Amanda Reider Apel, Aindrila Mukhopadhyay, Héctor García Martín, Jay D. Keasling
- 单位
- Biological Systems and Engineering Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, USA; Lawrence Berkeley National Laboratory, Joint BioEnergy Institute, Emeryville, CA, USA; Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California Berkeley, Berkeley, CA, USA; DOE Agile Biofoundry, Emeryville, CA, USA; BCAM, Basque Center for Applied Mathematics, Mazarredo, Bilbao, Basque Country, Spain; Department of Bioengineering, University of California Berkeley, Berkeley, CA, USA; Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Technical University of Denmark, Hørsholm, Denmark
- 杂志
- Frontiers in Bioengineering and Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.3389/fbioe.2017.00031
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
探索Sip1在葡萄糖抑制条件下（特别是存在半乳糖时）对酿酒酵母代谢的影响，并揭示半乳糖在葡萄糖抑制培养基中是否被细胞感知并引起代谢重分布。
研究策略
利用2-尺度13C代谢通量分析（2S-13C MFA）结合基因组尺度模型iMM904，在CEN.PK113-7D gal1Δ背景的base和sip1Δ菌株中，比较四种培养条件（葡萄糖-only与葡萄糖+半乳糖）下的细胞内外通量，通过ELVA和13C FVA确保模型一致性。
核心内容
本研究利用二维尺度13C代谢通量分析（2S-13C MFA）结合基因组尺度模型iMM904，在酿酒酵母CEN.PK113-7D gal1Δ背景下系统考察了Sip1敲除及半乳糖存在对中央碳代谢的影响。通过比较base和sip1Δ菌株在葡萄糖-only与葡萄糖+半乳糖四种条件下的细胞内外通量，发现经典葡萄糖抑制在1:10的半乳糖/葡萄糖比例下被显著削弱：加入0.2%半乳糖使base菌株最大比生长速率从0.375 h⁻¹增至0.407 h⁻¹（约8.5%），sip1Δ菌株则从0.372 h⁻¹增至0.440 h⁻¹（约18%），且sip1Δ在混合糖中较base生长快约8%。半乳糖的添加使磷酸戊糖途径通量骤减约94%，同时激活线粒体代谢，苹果酸和丙酮酸导入显著增加并促进缬氨酸合成。在葡萄糖-only条件下，SIP1敲除虽不改变生长速率，但使葡萄糖消耗率降低约44%、乙醇排泄率降低约72%；而在混合糖条件下，敲除株的葡萄糖通量反而增加约98%。这一结果表明Sip1作为Snf1复合物β亚基，在半乳糖存在时通过调节碳通量重分布影响生长表型，首次从通量水平揭示了葡萄糖抑制条件下半乳糖感知与Sip1功能的相互作用。
创新点
首次将2S-13C MFA应用于研究Sip1敲除和半乳糖存在下的通量变化；发现在经典葡萄糖抑制条件下，半乳糖的存在显著增加最大比生长速率并导致PPP通量大幅下降和线粒体活动增强；揭示了SIP1敲除在混合糖培养基中的生长优势，以及在葡萄糖-only培养基中无生长表型但通量显著改变的现象。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D (gal1Δ) | 半乳糖代谢 | GAL1 | 半乳糖激酶 | 催化 | 敲除以阻断半乳糖代谢，从而分离半乳糖代谢与葡萄糖抑制效应 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D (gal1Δ) | Snf1信号通路/葡萄糖抑制 | SIP1 | Sip1 (Snf1激酶复合物β亚基) | 调控 | 敲除导致在半乳糖存在下生长速率增加约8%，在葡萄糖-only培养基中无生长表型但改变通量 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D (gal1Δ) | 半乳糖利用 | GAL2 | 半乳糖通透酶 | 转运 | Sip1负调控其表达，但CEN.PK113-7D为gal2-，可能影响半乳糖进入 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D (gal1Δ) | 半乳糖调控 | GAL3 | Gal3半乳糖感应蛋白 | 调控 | 半乳糖存在时激活Gal4，解除Gal80抑制 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D (gal1Δ) | 半乳糖调控 | GAL80 | Gal80 | 调控 | 抑制Gal4，受Gal3调控 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D (gal1Δ) | 半乳糖调控 | GAL4 | Gal4转录激活因子 | 调控 | 激活交替碳源利用相关基因 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D (gal1Δ) | 磷酸戊糖途径 | G6PDH2 (ZWF1) | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 | 催化 | 加入半乳糖后PPP通量减少约93-94% |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D (gal1Δ) | 天冬氨酸/苏氨酸生物合成 | ASPTA, PC | 天冬氨酸转氨酶和丙酮酸羧化酶 | 催化 | SIP1敲除或加入半乳糖均导致该通量显著下降 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D (gal1Δ) | 线粒体转运 | — | 苹果酸/丙酮酸转运蛋白 | 转运 | 加入半乳糖后线粒体对苹果酸和丙酮酸的导入显著增加 |
关键发现
- 在CEN.PK113-7D gal1Δ背景中，加入0.2%半乳糖使base菌株最大比生长速率从0.375±0.007 h^-1增至0.407±0.004 h^-1（约8.5%增加），sip1Δ菌株从0.372±0.009 h^-1增至0.440±0.003 h^-1（约18%增加）
- sip1Δ相比base在混合糖培养基中生长速率增加约8%（0.440 vs 0.407 h^-1），但在葡萄糖-only培养基中无差异。PPP通量在加入半乳糖后减少约94%（base）和约93%（sip1Δ）。在葡萄糖-only条件下，sip1Δ相比base的葡萄糖消耗率降低约44%，乙醇排泄率降低约72%
- 在混合糖条件下，sip1Δ相比base的葡萄糖通量增加约98%，乙醇通量增加约70%，乙酸通量增加约54%。天冬氨酸/苏氨酸生物合成通量在SIP1敲除后降低约41%（PC降低35%），加入半乳糖后base降低约80%（PC增加10%），sip1Δ降低约66%（PC增加32%）。TCA循环和乙醛酸循环几乎完全抑制（约1%的通量）。加入半乳糖后，线粒体苹果酸和丙酮酸导入显著增加，并促进缬氨酸生物合成。
研究结论
葡萄糖抑制在1:10的半乳糖/葡萄糖比例下被削弱，半乳糖的存在使PPP通量降低并激活线粒体代谢，增加生长速率；Sip1作为Snf1复合物的β亚基，在半乳糖存在时调节生长表型，其敲除在葡萄糖-only培养基中虽不改变生长速率，但显著影响碳通量分布。本研究首次从通量水平揭示了这些相互作用。