Single cell profiling framework reveals metabolic subpopulations as drivers of bioproduction heterogeneity
- 作者
- Juline Savigny, Kiyan Shabestary, Maria Portela, Cinzia Klemm, Yvette Sum, Piotr Hapeta, Marko Storch, Christopher Rowlands, Rodrigo Ledesma-Amaro
- 单位
- Department of Bioengineering, Imperial College London; London Biofoundry, Translation and Innovation Hub, Imperial College White City Campus; Department of Infectious Disease, Imperial College London; Bezos Centre for Sustainable Protein, Imperial College London; UKRI Engineering Biology Mission Hub on Microbial Food, Imperial College London
- 杂志
- Nature Communications（2025）
- DOI
- 10.1038/s41467-025-67408-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆群体内表型异质性会降低生物生产产量，但缺乏在单细胞水平定量代谢状态的技术手段，限制了对异质性成因和影响的研究。
研究策略
构建基于单细胞生物传感器的模块化、标准化框架（YTK-ScBiosense），将靶向不同核心代谢物的生物传感器整合进酵母MoClo YTK toolkit，结合流式细胞术、显微成像和分选技术，系统表征环境扰动下的代谢亚群，并以胞内pH为标记研究亚群对紫色杆菌素和番茄红素生产异质性的影响，进而通过碳源调控亚群比例。
核心内容
该研究构建了基于酵母MoClo YTK toolkit的模块化单细胞代谢传感框架（YTK-ScBiosense），整合7个传感部分、4种荧光报告子、23个启动子和13个整合位点，用于定量解析克隆群体中的代谢异质性及其对生物生产的影响。通过流式细胞术、显微成像和分选技术，研究系统表征了环境扰动下的代谢亚群，发现葡萄糖急性或逐渐耗竭可诱导代谢亚群分化，并识别出以胞内pH（pHi）为标志的亚群是生物生产异质性的驱动因素，且该影响具有产品依赖性：紫色杆菌素生产中低pHi亚群高产（自发荧光从24h的0.28 a.u.增至72h的2.06 a.u.，效率比高pHi亚群高82%），而番茄红素生产中低pHi亚群低产（拉曼峰面积仅为高pHi亚群的约四分之一）。此外，以半乳糖替代葡萄糖作为碳源可调控亚群动态，使番茄红素产量从1.09 mg/L增至2.12 mg/L（1.94倍），单位生物量产量从0.021 mg/g增至0.035 mg/g。该框架为系统量化代谢异质性、分离代谢亚群并指导培养策略优化提供了通用工具，也为构建更稳健高产的工业菌株奠定了方法学基础。
创新点
建立了包含7个传感部分、4个荧光蛋白报告子、23个启动子和13个整合位点的标准化生物传感器工具箱；发现葡萄糖急性/逐渐耗竭可诱导代谢亚群分化；揭示pH_i亚群是生物生产异质性的驱动因素，且产品依赖性相反（紫色杆菌素低pH亚群高产，番茄红素低pH亚群低产）；提出以半乳糖为碳源调控亚群动态从而提高番茄红素产量。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 中央碳代谢/糖酵解 | — | pHluorin2 | 调控 | 胞内pH生物传感器，用于标记亚群 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | NADPH稳态 | pYRE | pYRE-mNeon | 调控 | NADPH响应转录因子传感器 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 糖酵解 | — | FBPs (2.6 C45-HRRz) | 调控 | 果糖-1,6-二磷酸核酶传感器 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 能量代谢 | yAT1.03 | yAT1.03 | 调控 | 绝对ATP水平传感器 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 能量代谢 | PercevalHR | PercevalHR | 调控 | ATP:ADP比值传感器 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 生长调控 | pRPL28 | pRPL28-mScarletI | 调控 | 基于核糖体蛋白启动子的生长传感器 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | NADH稳态 | pGPD2 | pGPD2-mNeon | 调控 | NADH响应启动子传感器 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 甘油合成/NADH氧化 | GPD1, GPD2 | Gpd1p, Gpd2p | 催化 | 用于验证pGPD2传感器功能，gpd1Δgpd2Δ突变体NADH积累 |
| Saccharomyces cerevisiae | 番茄红素生物合成 | — | — | 催化 | 生产菌株中引入番茄红素合成途径 |
| Saccharomyces cerevisiae | 紫色杆菌素生物合成 | — | — | 催化 | 生产菌株中引入紫色杆菌素合成途径 |
| Saccharomyces cerevisiae | 碳源代谢 | — | mNeonGreen, mScarletI | 调控 | 荧光报告蛋白，用于替代报告子或pH稳健对照 |
关键发现
- pHluorin2信号在5mM和10mM山梨酸处理下分别降低38%和47%
- pYRE-mNeon信号与diamide浓度呈强正相关（Pearson ρ=0.97）
- FBP传感器信号在丙酮酸条件下比葡萄糖高65%（阳性对照为53%）
- PercevalHR和yAT1.03在抗霉素A处理下信号分别降低1.69倍和1.19倍
- gpd1Δgpd2Δ菌株的pGPD2-mNeon信号比WT高1.20倍
- CSTRAVE条件下p2亚群CFU为424而p1为132
- p2在PBS中7天存活率为26.5%，p1为7.63%，存活率提高3.35倍
- 紫色杆菌素MCF中p1的紫色杆菌素自发荧光从24h的0.28 a.u.增至72h的2.06 a.u.（7.36倍），p2效率低82%
- 番茄红素MCF中p2的拉曼峰面积（0.074 a.u.）是p1（0.020 a.u.）的3.71倍
- p1亚群频率在葡萄糖条件下为69.8%，半乳糖条件下降至31.6%
- 半乳糖培养使番茄红素产量从1.09 mg/L增至2.12 mg/L（1.94倍），单位生物量产量从0.021 mg/g增至0.035 mg/g
- 紫色杆菌素MCF中p1频率从葡萄糖到半乳糖下降22%。
研究结论
本研究建立的单细胞代谢传感框架能够系统量化环境扰动下的代谢异质性并分离代谢亚群；葡萄糖耗竭是亚群分化的强触发因素；pH_i亚群可作为生物生产效率和菌株鲁棒性的标记，指导培养策略优化；通过半乳糖培养可调控亚群动态并提高番茄红素产量，为构建更稳健、高产的菌株提供了新思路。