高级醇 · 代谢工程文献库

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Designing an oxidase toolbox for site-directed oxidation of taxanes

作者
Mingyuan Lai, Yu Weng, Jian Wei, Xin-Yi Lu, Zhengyu Huang, Hangcheng Li, Longhao Huang, Zhijun Zhang, Lili Zhu, Jian-He Xu, Ran Hong, Hui-Lei Yu
单位
State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, Shanghai Collaborative Innovation Centre for Biomanufacturing, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, PR China; State Key Laboratory of Chemical Biology, Shanghai Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, PR China
杂志
Nature Communications（2025）
DOI
10.1038/s41467-025-67544-4
所属领域
代谢工程 / 合成生物学
关键词
位点定向氧化生物合成紫杉二烯紫杉醇蛋白质工程非特异性过氧合酶
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解决的核心问题

紫杉醇合成中天然P450酶活性低、选择性差，导致下游氧化步骤效率低，缺乏非天然氧化酶替代方案

研究策略

从29种真菌氧化酶中筛选出对紫杉二烯活性最高的TteUPO，解析其晶体结构（PDB 9IZ8，1.54Å），通过底物通道工程（丙氨酸扫描、FLA/STY扫描、饱和突变）改造突变体的活性与区域选择性，构建覆盖C-4、C-6、C-10、C-11、C-12、C-13位点的氧化酶工具箱，并与工程大肠杆菌紫杉二烯底盘整合，实现氧化紫杉烷的脱新生物合成

研究路线图

100%
研究问题：P450酶活性低、选择性差，缺乏非天然替代方案
策略：从29种真菌氧化酶中筛选，确定TteUPO为最优酶
关键改造1：解析TteUPO晶体结构（1.54Å），确定底物通道关键位点
关键改造2：丙氨酸扫描＋FLA/STY＋饱和突变，构建多位点突变体库
关键改造3：L208A（TON提高53倍）、L60A（C-4/6/10/11/12/13位点氧化）、L60A/F156L（C-10/C-13羟基化＞90%）、L60A/G159L（C-10选择性66%）、L60A/G159L/L208A（C-13选择性33%）
关键改造4：TteUPO突变体导入大肠杆菌，截短N端信号肽实现功能表达
结果：氧化酶工具箱覆盖6位点；L208A转化率95.6%；体外2h产率75.3%；体内从头合成滴度14.2mg/L
结论：TteUPO工具箱实现紫杉烷多位点定向氧化，体内外整合成功
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核心内容

该研究旨在解决紫杉醇合成中天然P450酶活性低、选择性差的问题，提出以非P450氧化酶替代的非常规策略。作者从29种真菌氧化酶中筛选出对紫杉二烯活性最高的TteUPO，解析其1.54 Å晶体结构，发现底物通道空间位阻决定活性和区域选择性。通过丙氨酸扫描与饱和突变，构建了覆盖C-4、C-6、C-10、C-11、C-12、C-13六个位点的氧化酶工具箱。其中L208A突变体总周转数较野生型提高53倍达4355，转化率95.6%；L60A/G159L/L208A三重突变体在100 mL反应中催化0.5 mM紫杉二烯2小时产率达75.3%，C-13选择性提升至33%。进一步将L208A突变体截短N端信号肽后整合至工程大肠杆菌紫杉二烯底盘，配合外源H2O2补料，实现氧化紫杉烷的脱新生物合成，总滴度达14.2 mg/L，同位素实验证实H2O2为氧供体。该工具箱展示了体外与体内整合潜能，为紫杉醇类化合物的高效合成提供了新型酶学路径。

创新点

1. 首次报道非P450氧化酶（TteUPO）催化紫杉烷氧化；2. 解析TteUPO晶体结构并揭示底物通道空间位阻是活性和选择性的主要决定因素；3. 构建由TteUPO突变体组成的氧化酶工具箱，实现六个位点的定向氧化；4. 在大肠杆菌中实现氧化紫杉二烯的从头合成

研究对象（3）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Pichia pastoris X-33 异源表达与蛋白生产 tteUPO (WT, L208A, L60A, L60A/F156A, L60A/F156L, L60A/G159L, L60A/G159L/L208A) TteUPO及其突变体 催化 所有TteUPO突变体均在此宿主中表达并用于活性筛选、产物制备和晶体学分析
Escherichia coli BL21(DE3) 紫杉二烯生物合成 dxs, idi, ggpps, ts DXS, IDI, GGPPS, TS 催化 过表达这些基因以增强异戊二烯前体（IPP/DMAPP）供应，提高紫杉二烯产量
Escherichia coli BL21(DE3) 紫杉烷氧化（脱新生物合成） tteUPO-L208A（去除N端信号肽） TteUPO L208A突变体 催化 将该突变体导入紫杉二烯生产底盘，外源添加H2O2完成氧化紫杉烷的从头合成

关键发现

  1. 从29种真菌氧化酶中筛选，13种对紫杉二烯有活性，TteUPO活性最高
  2. L208A突变体总周转数（TON）从82提高到4355，提高53倍，转化率达95.6%
  3. L60A突变体扩展产物多样性，可氧化C-4、C-6、C-10、C-11、C-12、C-13位点
  4. L60A/F156L突变体使C-10和C-13羟基化产物及C-11、C-12环氧化产物占总产物90%以上
  5. L60A/G159L突变体对C-10和C-13羟基化产物比例分别达66%和19%，转化率80.2%
  6. 三重突变体L60A/G159L/L208A TON达757，C-13选择性提高至33%，在100mL反应中0.5mM紫杉二烯催化2小时产率达75.3%
  7. L208A对含C2-羰基的taxane衍生物选择性氧化，产物占比99%以上
  8. 在大肠杆菌中通过N端信号肽截短实现L208A功能表达，配合外源H2O2补料，脱新生物合成氧化紫杉烷产物总滴度达14.2mg/L
  9. 同位素标记实验证明H2O2为氧供体

研究结论

通过TteUPO突变体工具箱，成功实现紫杉烷多位点定向氧化，为紫杉醇及其类似物的高效合成提供了非传统策略，并展示了该工具箱在体外与体内（大肠杆菌）的整合潜能