Tuning aromatic cage occupancy in prenyltransferases enables selective and efficient production of rare c-prenylated flavonoids
- 作者
- Ruiying Qiu, Huisi Huang, Junxi Chi, Longwei Gao, Qilin Gao, Min Li, Menghao Cai, Haishuang Yu, Shijie Wang, Zhilan Qian, Minchuan Jiang, Yu Liu, Bo Chen, Yang Zhou, Zhi-Min Zhang, Jian-bo Wang
- 单位
- Key Laboratory of Chemical Biology and Traditional Chinese Medicine Research (Ministry of Education) and Key Laboratory of Phytochemistry R&D of Hunan Province, College of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan Normal University, Changsha, 410081, P. R. China; Department of Microbiology, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou, 310058, P. R. China; Key Laboratory of Multiple Organ Failure (Zhejiang University), Ministry of Education, Department of General Intensive Care Unit of the Second Affiliated Hospital (Zhejiang University), Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou, 310058, P. R. China; Institute of Pharmaceutical Biotechnology Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou, 310058, P. R. China; State Key Laboratory of Bioactive Molecules and Draggability Assessment, Jinan University, Guangzhou, 511436, P. R. China; Key Laboratory of Tea Science of Ministry of Education, College of Horticulture, Hunan Agricultural University, Changsha, 410000, P. R. China; State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China; College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou, 310058, P. R. China
- 杂志
- Nature Communications（2026）
- DOI
- 10.1038/s41467-026-69706-4
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
C-异戊烯基黄酮类化合物具有显著药物潜力，但其不稳定多酚核心的选择性异戊烯化极具挑战；天然异戊烯基转移酶活性低、机制不明，难以高效制备稀有C-异戊烯基黄酮。
研究策略
以AtaPT为起点，采用半理性定向进化（SSM、ISM、FRISM）重塑活性口袋，结合晶体结构解析、分子对接与分子动力学模拟，揭示芳香笼结构域对区域选择性和供体特异性的调控机制，并将该机制移植到同源酶，进一步耦合异戊烯醇利用途径实现供体原位再生与放大合成。
研究路线图
核心内容
该研究针对C-异戊烯基黄酮选择性合成难题，以异戊烯基转移酶AtaPT为起点开展半理性定向进化，综合运用晶体结构解析、分子对接和分子动力学模拟，揭示了芳香笼结构域对区域选择性和供体特异性的关键调控机制。通过重塑活性口袋获得三个高性能突变体：M8实现8位逆异戊烯化，使山奈酚产物转化率从野生型不足1%提升至44.5%、选择性达77.4%，催化效率提高约45倍；G326W实现3′-异戊烯化，选择性达95.8%；M7实现3′-香叶基化，转化率超过90.7%，催化效率较野生型提高约40倍。该机制成功移植至AfaPT、AaaPT和AmaPT等同源酶，总活性最高提升19倍，特定产物形成最高提高862倍。进一步耦联异戊烯醇利用途径实现供体原位再生，在制备规模反应中获得218至442 mg/L的产量，共合成31种异戊烯基黄酮，其中8种为新化合物。该工作建立了高效可规模化的黄酮异戊烯化生物催化平台，为异戊烯基黄酮类药物先导物的绿色合成提供了机制见解和实用策略。
创新点
1. 发现并验证异戊烯基转移酶中芳香笼结构域是决定区域选择性与供体特异性的关键元件；2. 获得三个高性能突变体M8、G326W、M7，分别实现8位逆异戊烯化、3'-异戊烯化和3'-香叶基化；3. 证明芳香笼机制可转移至同源酶，通过机制指导设计显著提升催化性能；4. 建立模块化级联生物催化平台，实现31种异戊烯基黄酮的可规模合成，其中8种为新化合物。
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异戊二烯供体代谢 | ataPT | AtaPT | 催化 | 来源于Aspergillus terreus的芳香异戊烯基转移酶，底物杂泛性广，是定向进化的起始酶 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 黄酮异戊烯化 | ataPT-M8 | AtaPT-M8 | 催化 | 八位点突变体（I167A/E169A/S170Q/C175M/S177A/L323Q/P324H/N328R），高效催化kaempferol的8位逆异戊烯化 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 黄酮异戊烯化 | ataPT-G326W | AtaPT-G326W | 催化 | 单点突变体，专一利用DMAPP催化3'-C-异戊烯化，活性与选择性显著提高 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 黄酮异戊烯化 | ataPT-M7 | AtaPT-M7 | 催化 | 七位点突变体（I167T/E169A/S170Q/S177G/L323Q/P324H/N328M），高效催化3'-C-香叶基化 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 黄酮异戊烯化 | afaPT | AfaPT | 催化 | AtaPT同源酶（94.81%同一性），引入M7/M8突变后活性和选择性大幅提升 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 黄酮异戊烯化 | aaaPT | AaaPT | 催化 | AtaPT同源酶（86.70%同一性），引入M7/M8突变后活性显著提高 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 黄酮异戊烯化 | amaPT | AmaPT | 催化 | AtaPT同源酶（56.87%同一性），需额外重塑口袋（Y193S/M253L/M327G）以提升催化能力 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异戊烯醇利用途径（IUP） | AtIPK | AtIPK | 催化 | 拟南芥异戊烯基磷酸激酶，用于将异戊烯醇磷酸化生成DMAPP |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异戊烯醇利用途径（IUP） | EcPK | EcPK | 催化 | 大肠杆菌磷酸激酶，与IPK偶联催化异戊烯醇两步磷酸化 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异戊烯醇利用途径（IUP） | MjIPK | MjIPK | 催化 | 来源于Methanocaldococcus jannaschii的异戊烯基磷酸激酶，活性优于AtIPK（转化率23.1%） |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异戊烯醇利用途径（IUP） | MTHIPK | MTHIPK | 催化 | 来源于Methanothermobacter thermautotrophicus的异戊烯基磷酸激酶，用于DMAPP再生 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 香叶醇激酶途径 | Folk | Folk | 催化 | 拟南芥法尼醇激酶，可接受香叶醇为底物，但表达和溶解性较差 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 香叶醇激酶途径 | THAIPKG | THAIPKG | 催化 | 嗜酸热原体异戊烯基磷酸激酶突变体（Y70A/V130A/I140A），可磷酸化香叶基磷酸生成GPP |
关键发现
- 野生型AtaPT对kaempferol的8-异戊烯化产物2a转化率<1%，选择性仅34%
- 经定向进化获得突变体M8（I167A/E169A/S170Q/C175M/S177A/L323Q/P324H/N328R），2a转化率达44.5%、选择性77.4%，催化效率kcat/Km=34.79 s^-1 M^-1（DMAPP），较野生型提高约45倍
- 突变体G326W对3a转化率16.6%、选择性95.8%，kcat/Km=15.09 s^-1 M^-1
- 突变体M7（I167T/E169A/S170Q/S177G/L323Q/P324H/N328M）对3'-香叶基化产物6a转化率>90.7%、选择性92.6%，kcat=0.64 min^-1，Km=0.23 mM，kcat/Km=47.12 s^-1 M^-1，较野生型（1.12 s^-1 M^-1）提高约40倍。同源酶工程中AfaPT-M8和AaaPT-M8总活性分别提高14倍和19倍（22.9%和25.6%），2a形成分别提高24倍和66倍
- AfaPT-M7和AaaPT-M7的6a形成分别提高11倍和9倍（70.7%和63.2%）
- AmaPT-M7-SLG使6a形成提高约862倍，选择性提高近8倍。制备规模反应中2a、2f和2j的产量分别为218 mg/L、221 mg/L和442 mg/L，另有11个产品在50 mL反应中达到40-300 mg/L。共合成31种异戊烯基黄酮，其中8种（2f、3c、3f、3h、3j、4c、4f、4h）为首次报道。晶体结构分辨率：M8为2.50 Å（PDB: 9V5G），G326W为2.69 Å（PDB: 9V5F），M7为2.20 Å（PDB: 9V3U）。
研究结论
本研究通过定向进化成功重塑AtaPT活性口袋，揭示了芳香笼结构域对区域选择性和供体特异性的决定性作用，并证明该机制可推广至同源酶。结合原位供体再生系统，建立了高效、可规模化的黄酮异戊烯化生物催化平台，为异戊烯基黄酮类药物先导物的绿色合成提供了新策略和机制见解。