Discovery and engineering of bacterial P450s for C-14 hydroxylation in ent-kaurane diterpenoids
- 作者
- Xiaoxu Lin, Zhixi Xiao, Xingwang Xu, Xiaowei Zhang, Xingming Pan, Chenxi Zhu, Chenxi He, Li Feng, Fang-Ru Li, Hui-Min Xu, Zhe Wang, Ninghua Tan, Liao-Bin Dong
- 单位
- State Key Laboratory of Natural Medicines, School of Traditional Chinese Pharmacy, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China; Mudi Meng Honors College, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China; School of Pharmacy, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China; The Public Laboratory Platform, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China
- 杂志
- Nature Communications（2026）
- DOI
- 10.1038/s41467-026-70157-0
- 所属领域
- 代谢工程与合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
在ent-kaurane二萜类化合物中特异性地引入C-14羟基，该基团是药物活性关键但化学合成困难。
研究策略
开发计算血红素引导的位点特异性(CHS)策略，结合分子对接、MD模拟筛选细菌P450，并通过MM/PBSA引导的活性位点突变和氧化还原伴侣配对优化酶性能。
研究路线图
核心内容
本研究开发了计算血红素引导的位点特异性（CHS）策略，用于在ent-kaurane二萜类化合物中精准发现催化C-14羟化的细菌P450酶。通过分子对接与分子动力学模拟筛选，鉴定出CYP260A1、CYP105N1和CYP154C5三个候选酶，其中CYP260A1与底物C-14位距离仅3.5 Å。随后采用MM/PBSA引导的虚拟饱和突变改造CYP260A1，获得L162V突变体，并与CamA/CamB氧化还原伴侣蛋白配对，在工程大肠杆菌中使产物(14R,16R)-ent-kauran-14,16-diol的产量达到84.2±10.3 mg/L，较初始条件提升83倍。构效关系研究表明，C-14羟基与C15-C16 Michael受体存在协同作用，含双活性基团的化合物27对HCT116和LLC细胞系的IC50分别达1.4±0.7 μM和2.1±0.5 μM，活性较顺铂强25倍、较冬凌草甲素强8倍，并通过激活caspase依赖性凋亡通路发挥细胞毒作用。该研究为ent-kaurane二萜类药物的C-14位修饰提供了高效酶学工具和理性设计框架。
创新点
['开发CHS计算策略，实现C-14羟化酶的精准发现', '通过MM/PBSA和FoldX引导的虚拟饱和突变，获得L162V突变体使产量提升83倍', '阐明了C-14羟基与C15-C16 Michael受体对细胞毒性的协同作用']
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli (E. coli BL21(DE3)) | 人工异戊二烯途径(PhoN-IPK)及ent-kaurane二萜生物合成 | phoN, ipk, idi, ggdps, ecdps, ptmT3, BjKS, eKS | PhoN, IPK, IDI, GGDPS, eCDPS, PtmT3, BjKS, eKS | 催化 | 模块I：用于生产底物(16R)-ent-kauran-16-ol (1) |
| E. coli | ent-kaurane二萜代谢 | CYP260A1 | CYP260A1 | 催化 | C-14羟化酶，L162V突变后产量显著提升 |
| E. coli | ent-kaurane二萜代谢 | CYP105N1 | CYP105N1 | 催化 | C-14羟化酶 |
| E. coli | ent-kaurane二萜代谢 | CYP154C5 | CYP154C5 | 催化 | C-14和C-17羟化酶 |
| E. coli | ent-kaurane二萜代谢 | CYP105D7 | CYP105D7 | 催化 | C-3羟化酶 |
| E. coli | P450氧化还原系统 | camA, camB | CamA, CamB | 能量供给 | 来自Pseudomonas putida的氧化还原伴侣，为CYP260A1提供电子 |
| E. coli | P450氧化还原系统 | RhFRed | RhFRed | 能量供给 | 来自Rhodococcus sp. NCIMB 9784的氧化还原伴侣 |
关键发现
- ['通过CHS策略发现并验证了三个细菌P450（CYP260A1、CYP105N1、CYP154C5）能催化ent-kaurane二萜的C-14羟化，CYP260A1与底物C-14距离3.5Å', 'CYP260A1 L162V变体与CamA/CamB配对后，产物(14R,16R)-ent-kauran-14,16-diol (2)的产量达到84.2±10.3 mg/L，较初始条件提高83倍', '在底物范围测试中，化合物7体内产量41.7 mg/L，体外转化率35%
- 化合物8转化率9%
- 化合物6、12、24转化率分别为30%、30%、39%', 'SAR研究表明C-14羟基与C15-C16 Michael acceptor协同增效，化合物27对HCT116细胞IC50为1.4±0.7 μM，对LLC细胞IC50为2.1±0.5 μM，其活性比顺铂强25倍、比冬凌草甲素强8倍', '化合物27通过激活caspase依赖性凋亡发挥细胞毒作用，晚期凋亡细胞比例从6.83%（对照）升至39.1%，早期凋亡从3.16%升至30.2%']
研究结论
本研究开发了CHS策略用于发现细菌P450 C-14羟化酶，通过计算酶工程和氧化还原伴侣优化，显著提高了产量，并通过SAR揭示了C-14羟基与Michael受体的协同作用，为ent-KT修饰提供了框架。