Discovery of iridoid cyclase completes the iridoid pathway in asterids
- 作者
- Maite Colinas, Chloée Tymen, Joshua C. Wood, Anja David, Jens Wurlitzer, Clara Morweiser, Klaus Gase, Ryan M. Alam, Gabriel R. Titchiner, John P. Hamilton, Sarah Heinicke, Ron P. Dirks, Adriana A. Lopes, Lorenzo Caputi, C. Robin Buell, Sarah E. O'Connor
- 单位
- Max Planck Institute for Chemical Ecology, Jena, Germany
- 杂志
- Nature Plants（2025）
- DOI
- 10.1038/s41477-025-02122-6
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
环烯醚萜生物合成途径中由8-氧代香茅烯醇环化生成两种主要立体异构体萘丙醇的关键酶学步骤长期未知，导致该途径无法完整重构，限制了环烯醚萜类化合物及其衍生物的异源生产。
研究策略
通过de novo基因组组装和单核RNA测序共表达分析筛选候选基因，结合本氏烟草异源重构和体外酶活检测，从系统发育多样化的菊亚纲植物中鉴定出环烯醚萜环化酶（ICYC），并通过定点突变和VIGS验证其功能。
核心内容
环烯醚萜类化合物是多种药用生物碱生物合成的重要前体，但其途径中由8-氧代香茅烯醇环化生成萘丙醇的关键酶学步骤一直悬而未决，阻碍了该途径的完整重构与异源生产。本研究通过de novo基因组组装与单核RNA测序共表达分析，在本氏烟草中异源重构并结合体外酶活检测，从系统发育多样的菊亚纲植物中鉴定出环烯醚萜环化酶（ICYC）。该酶催化生成7S-顺式-反式和7R-顺式-顺式两种非对映异构体萘丙醇，与ISY共孵育时显著提升7S产物产量，并在7个代表物种中均成功重构马钱苷酸生物合成。病毒诱导基因沉默证实CrICYC在长春花体内负责环化，沉默后断马钱苷含量显著降低。定点突变表明催化三联体D210A和H238A使环化活性完全丧失。ICYC从甲基酯酶家族经功能趋同进化而来，与G8H形成保守基因簇，并在所有产环烯醚萜的菊亚纲目中普遍存在。该发现补全了环烯醚萜途径的缺失环节，为代谢工程异源合成环烯醚萜类化合物及药用生物碱提供了关键元件。
创新点
['首次发现并表征了菊亚纲植物中催化8-氧代香茅烯醇环化生成7S-顺式-反式和7R-顺式-顺式萘丙醇的ICYC酶', '证明ICYC从普遍存在的甲基酯酶（MES）家族趋同进化而来，具有非酯酶催化功能', '发现ICYC与ISY存在蛋白互作，提示潜在底物通道化机制', '揭示ICYC与G8H形成保守的生物合成基因簇，且该酶在所有产生环烯醚萜的菊亚纲目中均存在（除个别属）', '实现了环烯醚萜途径在异源宿主中的完整重构，为代谢工程生产环烯醚萜类化合物提供关键元件']
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana | 环烯醚萜生物合成途径 | CiICYC | Iridoid cyclase (ICYC) | 催化 | 来自Carapichea ipecacuanha，催化8-氧代香茅烯醇环化生成萘丙醇 |
| Nicotiana benthamiana | 环烯醚萜生物合成途径 | AsICYC | Iridoid cyclase (ICYC) | 催化 | 来自Alangium salvifolium（山茱萸目） |
| Nicotiana benthamiana | 环烯醚萜生物合成途径 | VcICYC | Iridoid cyclase (ICYC) | 催化 | 来自Vaccinium corymbosum（杜鹃花目） |
| Nicotiana benthamiana | 环烯醚萜生物合成途径 | LjICYC | Iridoid cyclase (ICYC) | 催化 | 来自Lonicera japonica（川续断目） |
| Nicotiana benthamiana | 环烯醚萜生物合成途径 | CrICYC | Iridoid cyclase (ICYC) | 催化 | 来自Catharanthus roseus（龙胆目，夹竹桃科） |
| Nicotiana benthamiana | 环烯醚萜生物合成途径 | SiICYC | Iridoid cyclase (ICYC) | 催化 | 来自Sesamum indicum（唇形目，胡麻科） |
| Nicotiana benthamiana | 环烯醚萜生物合成途径 | AmICYC | Iridoid cyclase (ICYC) | 催化 | 来自Antirrhinum majus（唇形目，车前科） |
| Escherichia coli | 环烯醚萜生物合成途径 | CrISY | Iridoid synthase (ISY) | 催化 | 来自Catharanthus roseus，7S选择性，还原8-氧代香茅醛并生成S-8-氧代香茅烯醇 |
| Escherichia coli | 环烯醚萜生物合成途径 | AmISY | Iridoid synthase (ISY) | 催化 | 来自Antirrhinum majus，7R选择性，生成R-8-氧代香茅烯醇 |
| Nicotiana benthamiana | 环烯醚萜生物合成途径 | GES, G8H, 8HGO, 7DLGT, 7DLH | Geraniol synthase, geraniol 8-hydroxylase, 8-hydroxylgeraniol oxidase, 7-deoxyloganetic acid glucosyltransferase, 7-deoxyloganic acid hydroxylase | 催化 | 上游及下游已表征的环烯醚萜途径酶，用于异源重构 |
| Nicotiana benthamiana | MEP途径 | DXS, DXR | 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase, 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase | 催化 | 为GPP前体提供异戊烯基焦磷酸，与环烯醚萜途径共表达 |
| Carapichea ipecacuanha | 环烯醚萜生物合成途径 | BIS转录因子 | bHLH转录因子 | 调控 | 调控IPAP细胞中环烯醚萜途径基因表达的转录因子 |
关键发现
- ['通过共表达网络筛选得到13个高表达候选基因，其中包含ICYC（CiICYC）
- 在N. benthamiana中表达CiICYC可高效产生马钱苷酸（loganic acid）', '体外酶活显示，ICYC与7S选择性CrISY共孵育显著增加7S-顺式-反式萘丙醇产量
- 与7R选择性AmISY共孵育产生新产物7R-顺式-顺式萘丙醇，经化学氧化和手性GC-MS确认', 'ICYC直系同源物在7个代表物种（A. salvifolium, V. corymbosum, L. japonica, C. roseus, S. indicum, A. majus, C. ipecacuanha）中均能在N. benthamiana中重构loganic acid生物合成', 'VIGS沉默C. roseus的CrICYC导致secologanin含量显著降低（P=0.0047，N=6），证实其在体内的环化功能', 'CiICYC催化三联体突变D210A和H238A使环化活性完全丧失，S83A保留部分活性，V15G和W133A降低产物量，H17A和G84A与野生型相当', '所有ICYC直系同源物均保留酯酶活性（以4-硝基苯乙酸酯为底物），但酯酶活性与环化活性不相关', 'ICYC基因与G8H在基因组上相邻形成保守基因簇，在产生环烯醚萜的菊亚纲目中普遍存在']
研究结论
本研究鉴定并表征了菊亚纲植物中环烯醚萜生物合成途径的关键环化酶ICYC，补全了7S/7R选择性萘丙醇形成的缺失步骤。ICYC从甲基酯酶家族经功能趋同进化而来，其发现为环烯醚萜类化合物的异源合成及药用生物碱的可持续生产奠定了基础。