A microbial supply chain for production of the anti-cancer drug vinblastine
- 作者
- Jie Zhang, Lea G. Hansen, Olga Gudich, Konrad Viehrig, Lærke M. M. Lassen, Lars Schrübbers, Khem B. Adhikari, Paulina Rubaszka, Elena Carrasquer-Alvarez, Ling Chen, Vasil D'Ambrosio, Beata Lehka, Ahmad K. Haidar, Saranya Nallapareddy, Konstantina Giannakou, Marcos Laloux, Dushica Arsovska, Marcus A. K. Jørgensen, Leanne Jade G. Chan, Mette Kristensen, Hanne B. Christensen, Suresh Sudarsan, Emily A. Stander, Edward Baidoo, Christopher J. Petzold, Tune Wulff, Sarah E. O'Connor, Vincent Couradvault, Michael K. Jensen, Jay D. Keasling
- 杂志
- Nature（2022）
- DOI
- 10.1038/s41586-022-05157-3
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
抗癌药物长春碱（vinblastine）的可持续生产面临植物提取产量极低和化学合成困难的问题，本研究旨在通过工程酵母建立微生物供应链，实现长春碱前体vindoline和catharanthine的从头生物合成，并经化学偶联生成长春碱。
研究策略
将长春花的31步长春碱生物合成途径分为三个模块（strictosidine、tabersonine/catharanthine和vindoline模块），在酿酒酵母中系统表达34个异源基因，并通过删除、敲低和过表达10个酵母基因（共56处基因编辑）优化前体供应，实现从葡萄糖和色氨酸从头合成vindoline和catharanthine，再经体外化学偶联生成vinblastine。
核心内容
该研究在酿酒酵母中重构了抗癌药物长春碱的完整微生物供应链，首次实现其两大前体vindoline和catharanthine的从头生物合成。研究者将长春花中31步的长春碱合成途径拆分为三个模块，系统表达了34个异源基因，并通过删除、敲低和过表达10个酵母基因（共56处基因编辑）优化前体供应。针对植物细胞色素P450酶在酵母中表达和定位困难的问题，通过同源酶筛选与蛋白工程加以解决。优化后，关键中间体strictosidine产量达25.2 mg/L；在ambr 250生物反应器中，最终菌株从头产生catharanthine 91.4 μg/L和vindoline 13.2 μg/L，纯化产物经化学偶联后检测到23.9 μg/L的长春碱。整个途径产量优化超过1000倍。这项工作证明了工程酵母可作为生产复杂植物源抗癌药物的可行平台，为以半合成方式补充或替代现有植物提取供应链奠定了基础，但当前产量距离工业化应用仍有较大差距。
创新点
首次在酵母中实现长春碱前体vindoline和catharanthine的从头生物合成；模块化重构超长生物合成途径；通过同源酶筛选和蛋白工程解决了植物细胞色素P450酶在微生物中的表达和定位问题；实现了从葡萄糖到长春碱的完整微生物供应链。
研究对象（40）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | G8H | geraniol 8-hydroxylase | 催化 | 细胞色素P450酶，催化香叶醇羟基化生成8-羟基香叶醇 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | 8HGO | 8-hydroxylgeraniol oxidoreductase | 催化 | 氧化还原酶，催化8-羟基香叶醇生成8-氧代香叶醛 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | ISY | iridoid synthase | 催化 | 催化8-氧代香叶醛环化生成nepetalactol |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | IO | iridoid oxidase | 催化 | 细胞色素P450酶，催化nepetalactol氧化 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | CYPADH | alcohol dehydrogenase 2 | 催化 | 醇脱氢酶，参与环烯醚萜醛的氧化 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | 7DLGT | 7-deoxyloganetic acid glucosyl transferase | 催化 | 糖基转移酶，催化7-脱氧马钱苷酸葡萄糖基化 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | 7DLH | 7-deoxyloganic acid hydroxylase | 催化 | 细胞色素P450酶，催化7-脱氧马钱苷酸羟基化 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | LAMT | loganic acid O-methyltransferase | 催化 | 催化马钱苷酸甲酯化生成马钱苷 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | SLS | secologanin synthase | 催化 | 细胞色素P450酶，催化马钱苷开环生成断马钱苷 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | STR | strictosidine synthase | 催化 | Pictet-Spengler缩合酶，催化色胺与断马钱苷缩合生成strictosidine |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | SGD | strictosidine-β-D-glucosidase | 催化 | 催化strictosidine去糖苷生成strictosidine aglycone |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | GS | geissoschizine synthase | 催化 | 催化strictosidine aglycone重排生成geissoschizine |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | GO | geissoschizine oxidase | 催化 | 细胞色素P450酶，催化geissoschizine氧化 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | Redox1 | protein redox 1 | 催化 | 氧化还原酶，参与双键还原 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | Redox2 | protein redox 2 | 催化 | 氧化还原酶，参与双键还原 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | SAT | stemnadenine O-acetyltransferase | 催化 | 乙酰转移酶，催化stemnadenine乙酰化 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | PAS | precondylocarpine acetate synthase | 催化 | 催化O-acetylstemnadiene氧化生成precondylocarpine acetate |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | DPAS | dihydroprecondylocarpine acetate synthase | 催化 | 催化precondylocarpine acetate还原 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | CS | catharanthine synthase | 催化 | 催化dihydroprecondylocarpine acetate生成catharanthine |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | TS | tabersonine synthase | 催化 | 催化dihydroprecondylocarpine acetate生成tabersonine |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | T16H1/T16H2 | tabersonine 16-hydroxylase | 催化 | 细胞色素P450酶，催化tabersonine C16羟基化 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | 16OMT | tabersonine 16-O-methyltransferase | 催化 | 催化16-hydroxytabersonine甲基化 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | T3O | tabersonine 3-oxygenase | 催化 | 细胞色素P450酶，催化tabersonine C3氧化 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | T3R | 16-methoxy-2,3-dihydro-3-hydroxytabersonine synthase | 催化 | 催化3-羟基-16-甲氧基-2,3-二氢tabersonine生成 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | NMT | 3-hydroxy-16-methoxy-2,3-dihydrotabersonine-N-methyltransferase | 催化 | 催化N-甲基化 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | D4H | deacetoxyvindoline 4-hydroxylase | 催化 | 催化deacetoxyvindoline C4羟基化 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | DAT | deacetylvindoline O-acetyltransferase | 催化 | 催化deacetylvindoline乙酰化生成vindoline |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | PRX1 | class III peroxidase | 催化 | 过氧化物酶，理论上催化vindoline和catharanthine偶联生成vinblastine，但在酵母中未成功表达 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | CPR | cytochrome P450 reductase | 催化 | 为细胞色素P450酶提供电子 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | CYB5 | cytochrome b5 | 催化 | 辅助细胞色素P450酶的电子传递 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 长春碱生物合成途径 | TDC | tryptophan decarboxylase | 催化 | 催化色氨酸脱羧生成色胺 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 萜类前体生物合成 | GES | geraniol synthase | 催化 | 催化GPP生成香叶醇 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 萜类前体生物合成 | GPPS (AgrGPPS2) | geranyl pyrophosphate synthase | 催化 | 催化IPP与DMAPP缩合生成GPP |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 萜类前体生物合成 | FPSN144W | farnesyl pyrophosphate synthase variant | 催化 | FPP合酶突变体，对GPP亲和力降低，有利于GPP积累 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 萜类前体生物合成 | ERG20F96W,N127W | farnesyl pyrophosphate synthase mutant | 催化 | 低FPP合酶活性的ERG20突变体，与GES融合以增强香叶醇合成 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 甲羟戊酸途径 | tHMG1 | truncated 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase | 催化 | 截短的HMG-CoA还原酶，提高甲羟戊酸通量 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 甲羟戊酸途径 | IDI1 | isopentenyl diphosphate isomerase | 催化 | 催化IPP与DMAPP互变 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 萜类前体生物合成 | ERG9 | squalene synthase | 催化 | 酵母基因，动态下调以减少GPP消耗并增加单萜前体 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 萜类前体生物合成 | ERG20 | farnesyl pyrophosphate synthase | 催化 | 酵母基因，动态下调以增加GPP/FPP比例 |
| 酿酒酵母 CEN.PK2-1C | 支路代谢 | ATF1 | alcohol acetyltransferase | 催化 | 酵母基因，敲除以减少香叶醇副产物形成 |
关键发现
- 优化后strictosidine产量达到25.2 mg/L (47.4 μM)（96孔板）；MIA-EM-2菌株在ambr 250生物反应器中从头产生catharanthine
- 4 μg/L (271 nM) 和vindoline
- 2 μg/L (29.0 nM)；通过Fe(III)化学偶联从酵母纯化产物中检测到23.9 μg/L (29.4 nM) vinblastine；整个途径优化超过1000倍，共进行56处基因编辑，表达34个异源基因。
研究结论
本研究证明酿酒酵母可作为生产复杂抗癌药物长春碱前体的微生物平台，通过半合成实现长春碱的微生物供应链，但仍需进一步代谢工程和过程优化以补充或取代现有的植物提取供应链。