Mandipropamid as a chemical inducer of proximity for in vivo applications
- 作者
- Michael J. Ziegler, Klaus Yserentant, Valentin Dunsing, Volker Middel, Antoni J. Gralak, Kaisa Pakari, Jörn Bargstedt, Christoph Kern, Annett Petrich, Salvatore Chiantia, Uwe Strähle, Dirk-Peter Herten, Richard Wombacher
- 杂志
- Nature Chemical Biology（2021）
- DOI
- 10.1038/s41589-021-00922-3
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
开发一种低毒性、高细胞通透性、快速高效且正交的化学诱导邻近（CIP）系统，以实现在活细胞和活体内的蛋白相互作用操控，克服现有 CIP 系统（如雷帕霉素毒性、植物激素类通透性差）的不足。
研究策略
利用农用杀菌剂 Mandipropamid（Mandi）与其工程化受体 PYR^Mandi（ABA 受体 PYR1 的六重突变体）以及 ABI 接收域之间的特异性结合，构建新型 CIP 系统。在哺乳动物细胞和斑马鱼胚胎中验证其快速蛋白易位能力，结合纳米抗体实现内源蛋白操纵，并与 ABA/GA 等 CIP 系统联用构建可逆多输入蛋白穿梭。
核心内容
该研究开发了一种基于农用杀菌剂Mandipropamid（Mandi）的新型化学诱导邻近（CIP）系统。研究者将ABA受体PYR1进行六重突变获得工程化受体PYR^Mandi，使其与Mandi特异性结合并招募ABI接收域，从而在哺乳动物细胞和斑马鱼胚胎中实现快速、可逆的蛋白相互作用操控。该系统响应速度显著优于现有工具：500 nM浓度下Mandi诱导蛋白易位的半时间（t0.75）为10.1秒，而雷帕霉素需107.9秒，快约10倍；其EC50为0.43 μM，比ABA低约72倍。Mandi兼具低毒性（大鼠LD50>5000 mg/kg）和高组织穿透性，在斑马鱼胚胎中5 μM处理72小时未观察到毒性。该系统还可与纳米抗体结合实现内源蛋白靶向操纵，并与ABA系统及拮抗剂revABA联用构成可逆的多输入蛋白穿梭。这一新型CIP工具为活体内复杂蛋白网络调控和合成生物学应用提供了高效、安全的技术方案。
创新点
1. 首次报道将农用化合物 Mandi 作为体内高效 CIP；2. 诱导速度比雷帕霉素快一个数量级以上（500 nM 下 t0.75 为 10.1 s vs 107.9 s）；3. 兼具低毒性（大鼠 LD50>5000 mg/kg）和优异组织穿透性，可在活体斑马鱼胚胎中快速诱导蛋白易位；4. 与纳米抗体结合实现对内源蛋白的靶向操纵；5. 与 ABA 系统及拮抗剂 revABA 组合，实现可逆的多输入蛋白穿梭。
研究对象（17）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 哺乳动物细胞 (COS-7, HEK293T等) 和斑马鱼胚胎 | ABA 信号通路 | PYR1 | PYR^Mandi (六重突变体) | 调控 | 作为 Mandi 的受体结构域，与 ABI 结合 |
| 哺乳动物细胞 (COS-7, HEK293T等) 和斑马鱼胚胎 | ABA 信号通路 | ABI | ABI | 调控 | 作为接收器结构域，与 PYR^Mandi 结合 |
| 哺乳动物细胞 (COS-7) | ABA 信号通路 | PYL | PYL | 调控 | ABA 的受体，用于 ABA 系统 |
| 哺乳动物细胞 (COS-7) | GA 信号通路 | GID1 | GID1 | 调控 | GA3 受体 |
| 哺乳动物细胞 (COS-7) | GA 信号通路 | GA1 | GA1 (DELLA蛋白) | 调控 | 与 GID1 结合 |
| 哺乳动物细胞 | 雷帕霉素/mTOR 信号通路 | FKBP1A | FKBP12 | 调控 | 雷帕霉素 CIP 的受体域 |
| 哺乳动物细胞 | 雷帕霉素/mTOR 信号通路 | MTOR | FRB (mTOR 的 FKBP12-雷帕霉素结合域) | 调控 | 与 FKBP12 结合 |
| HeLa (Lifeact-GFP) 和 REF (paxillin-YFP) | — | — | anti-GFP 纳米抗体 | 调控 | 作为衔接器，结合内源 GFP 融合蛋白 |
| COS-7 | — | TEV | TEV 蛋白酶 (N端和C端片段) | 催化 | CIP 诱导重构后裂解底物 |
| COS-7 | — | GAL4 | Gal4BD | 调控 | 结合 DNA 结合域 |
| COS-7 | — | VP16 | VP16 反式激活域 | 调控 | 激活转录 |
| COS-7 和斑马鱼胚胎 | — | TOMM20 | TOM20 | 区室化 | 线粒体外膜定位信号 |
| COS-7 和斑马鱼胚胎 | — | LYN | LYN | 区室化 | 质膜定位信号 |
| COS-7 | — | VIM | Vimentin | 区室化 | 中间丝定位 |
| COS-7 | — | KRT | Keratin | 区室化 | 角蛋白纤维定位 |
| HeLa | — | — | Lifeact | 区室化 | F-肌动蛋白结合肽 |
| REF | — | PXN | Paxillin | 区室化 | 粘着斑定位 |
关键发现
- ['Mandi 在 1 μM 时数秒内诱导共定位，100 nM 时约 1 分钟完成，10 nM 时 4 分钟后仍可检测到但效率较低。', '在 5 μM 浓度下，ABA、ABA-AM 和 GA3-AM 的 t0.75 分别为 10±0.8、3.5±0.1 和
- 4±0.5 分钟；Mandi 和雷帕霉素在此浓度下响应过快无法分辨。', '在 500 nM 浓度下，Mandi 的 t0.75 为
- 1±1.7 秒，雷帕霉素为
- 9±16.4 秒，Mandi 快约 10 倍；50 nM Mandi 仍比 500 nM 雷帕霉素快
- 2 倍以上。', 'EC50 方面，Mandi 为
- 43±0.17 μM，ABA 为
- 8±15.5 μM，Mandi 约低 72 倍。', 'RICS 结合效率：500 nM 刺激下，Mandi 为 77±12%，雷帕霉素为 71±3%，ABA-AM 为 41±6%。', '斑马鱼胚胎在 500 nM Mandi 下数分钟内实现共定位，5 μM 处理 72 小时未观察到毒性。', '毒性数据：大鼠急性口服 LD50 >5000 mg/kg，NOAEL 41 mg/kg/d。', '200 nM ABA-AM 时与 Mandi 系统交叉反应性低于 10%。']
研究结论
Mandi 是一个新型高效的 CIP，具备低毒、高细胞通透性和快速响应，适用于体内应用，与纳米抗体结合可操纵内源蛋白，与 ABA 系统组合可实现复杂蛋白网络操纵，有望成为细胞生物学和合成生物学的重要工具，并可能用于治疗。