Expression and functional analysis of the lysine decarboxylase and copper amine oxidase genes from the endophytic fungus Colletotrichum gloeosporioides ES026
- 作者
- Xiangmei Zhang, Zhangqian Wang, Saad Jan, Qian Yang, Mo Wang
- 杂志
- Scientific Reports（2017）
- DOI
- 10.1038/s41598-017-02834-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
石杉碱甲（HupA）是治疗阿尔茨海默病的重要化合物，但植物来源有限且提取成本高；内生真菌产量低且传代后生物合成能力丧失，需要阐明HupA生物合成关键酶并构建稳定高产的异源表达系统。
研究策略
对产HupA的内生真菌胶孢炭疽菌ES026进行转录组分析，克隆CgLDC和CgCAO基因；在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达并纯化重组蛋白，通过体外酶活测定验证其催化功能；构建含不同启动子的过表达质粒，经农杆菌介导转化C. gloeosporioides ES026，利用qRT-PCR和LC-HRMS分析基因表达与HupA产量的关系。
核心内容
该研究针对石杉碱甲（HupA）植物来源有限、内生真菌产量低且传代后合成能力丧失的问题，从产HupA的内生真菌胶孢炭疽菌ES026中克隆了赖氨酸脱羧酶基因CgLDC（769 bp）和铜胺氧化酶基因CgCAO（2072 bp），并分别在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，纯化得到表观分子量28 kDa和76 kDa的重组蛋白。体外酶活实验证实CgLDC催化L-赖氨酸生成尸胺，CgCAO进一步催化尸胺生成5-氨基戊醛（可自发环化为Δ1-哌啶），而失活酶无催化活性，从而明确了二者在HupA生物合成通路中承担的关键转化步骤。进一步通过农杆菌介导转化，在野生型菌株（HupA基础产量45 μg/g干菌丝体）中构建了含不同启动子的过表达株系，qRT-PCR显示PagdA-CgLDC和PalcA-CgCAO转化株基因表达水平最高，但HupA产量最高的分别是Polic-CgLDC和PgpDA-CgCAO转化株，且均高于野生型。该结果表明HupA合成受多个酶协同调控，并非基因表达量越高产量越大，但通过启动子优化获得的转化株为稳定高产HupA生产提供了可行策略。
创新点
['首次从C. gloeosporioides ES026中克隆并异源表达CgLDC和CgCAO，证实二者催化L-赖氨酸向5-氨基戊醛的转化', '通过不同启动子过表达策略，构建了稳定高产的HupA表达系统', '系统分析了CgLDC和CgCAO的理化性质及表达水平与HupA产量的关联']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21 (DE3) | 石杉碱甲生物合成通路 | CgLDC | CgLDC（赖氨酸脱羧酶） | 催化 | 异源表达并纯化，体外催化L-赖氨酸脱羧生成尸胺（cadaverine），蛋白28 kDa，含256个氨基酸 |
| Escherichia coli BL21 (DE3) | 石杉碱甲生物合成通路 | CgCAO | CgCAO（铜胺氧化酶） | 催化 | 异源表达并纯化，体外催化尸胺氧化脱氨生成5-氨基戊醛（可环化为Δ1-哌啶），蛋白76 kDa，含672个氨基酸 |
| Colletotrichum gloeosporioides ES026 | 石杉碱甲生物合成通路 | CgLDC | CgLDC（赖氨酸脱羧酶） | 催化 | 使用不同启动子（trpC、gpdA、alcA、olic、agdA）过表达，PagdA-CgLDC表达最高，但Polic-CgLDC的HupA产量最高 |
| Colletotrichum gloeosporioides ES026 | 石杉碱甲生物合成通路 | CgCAO | CgCAO（铜胺氧化酶） | 催化 | 使用不同启动子（trpC、gpdA、alcA、olic、agdA）过表达，PalcA-CgCAO表达最高，但PgpDA-CgCAO的HupA产量最高 |
关键发现
- ['野生型C. gloeosporioides ES026产HupA量为45 μg/g干菌丝体', 'CgLDC和CgCAO基因长度分别为769 bp和2072 bp，重组蛋白表观分子量为28 kDa和76 kDa', '体外酶活实验证实CgLDC催化L-赖氨酸生成尸胺，CgCAO催化尸胺生成5-氨基戊醛（可自发环化为Δ1-哌啶），对照失活酶无催化活性', 'qRT-PCR表明PagdA-CgLDC和PalcA-CgCAO转化株的基因表达水平最高，但HupA产量最高的分别是Polic-CgLDC和PgpDA-CgCAO转化株', 'CgLDC含256个氨基酸，理论pI为5.06，不稳定指数为48.51（不稳定）
- CgCAO含672个氨基酸，理论pI为5.60，不稳定指数为39.05（稳定）', '过表达CgLDC和CgCAO的转化株HupA产量高于野生型，但最高表达株未产生最高产量，表明HupA合成受多个酶协同调控']
研究结论
CgLDC和CgCAO是HupA生物合成途径的关键酶，参与L-赖氨酸至5-氨基戊醛的转化，并在调控C. gloeosporioides ES026中HupA含量中发挥重要作用；通过遗传改造获得的Polic-CgLDC和PgpDA-CgCAO转化株可实现稳定高产的HupA生产。