SmMYB36, a Novel R2R3-MYB Transcription Factor, Enhances Tanshinone Accumulation and Decreases Phenolic Acid Content in Salvia miltiorrhiza Hairy Roots
- 作者
- Kai Ding, Tianlin Pei, Zhengqing Bai, Yanyan Jia, Pengda Ma, Zongsuo Liang
- 杂志
- Scientific Reports（2017）
- DOI
- 10.1038/s41598-017-04909-w
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
丹参中丹参酮和酚酸两类主要活性成分的积累调控机制尚不清楚，缺乏能同时调控两类成分的内源转录因子。本研究旨在鉴定并功能表征一个新型内源R2R3-MYB转录因子SmMYB36，揭示其同时影响丹参酮和酚酸生物合成的调控机制。
研究策略
从丹参中克隆SmMYB36基因，进行序列分析、系统发育分析、亚细胞定位和转录激活活性检测；通过农杆菌介导构建SmMYB36过表达毛状根，利用HPLC和GC检测代谢物含量变化，用qRT-PCR分析酚酸和丹参酮生物合成通路基因表达水平；通过EMSA验证SmMYB36与MYB结合元件的直接相互作用。
研究路线图
核心内容
该研究从丹参中克隆得到一个新的R2R3-MYB转录因子基因SmMYB36，编码160个氨基酸，预测分子量为18 kDa。通过农杆菌介导法构建SmMYB36过表达毛状根，系统研究了其对丹参次生代谢的调控作用。结果显示，过表达SmMYB36显著提高丹参酮类成分的积累，毛状根红色明显加深，同时降低迷迭香酸、丹酚酸B、总酚和总黄酮含量。qRT-PCR分析表明，MEP途径基因（DXS1、DXS2、DXR、MCT、MDS、HDS、CMK、HDR1）及丹参酮下游合成基因（GGPPS1、CPS1、KSL1、CYP76AH1）表达显著上调，而苯丙烷途径（PAL1、C4H1、4CL2）和酪氨酸途径（TAT1、HPPR1）基因表达下调。脂肪酸分析显示总脂肪酸含量上升，其中亚油酸相对含量显著上升而油酸下降。EMSA实验证实SmMYB36能直接与C4H1、4CL2、HPPR1、DXR、MCT、GGPPS1等基因启动子中的MYB元件以及MBSI（AAAAAAC(C/G)GTTA）、MBSII（AAAAGTTAGTTA）等核心元件结合。该转录因子通过调节多个代谢通路基因表达，使代谢流从酚酸方向转向丹参酮方向，是丹参次生代谢工程的重要潜在工具。
创新点
首次报道内源R2R3-MYB转录因子SmMYB36能同时促进丹参酮积累并抑制酚酸合成；阐明其通过调节苯丙烷/酪氨酸衍生途径与MEP/丹参酮下游途径基因表达实现代谢流向切换；EMSA证明SmMYB36可与多种MYB顺式作用元件（MBS、MBSI、MBSII等）直接结合。
研究对象（14）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Salvia miltiorrhiza hairy roots | 苯丙烷代谢途径 | PAL1 | 苯丙氨酸解氨酶 | 催化 | 表达下调 |
| Salvia miltiorrhiza hairy roots | 苯丙烷代谢途径 | C4H1 | 肉桂酸4-羟化酶 | 催化 | 表达下调 |
| Salvia miltiorrhiza hairy roots | 苯丙烷代谢途径 | 4CL2 | 4-香豆酸辅酶A连接酶2 | 催化 | 表达下调 |
| Salvia miltiorrhiza hairy roots | 酪氨酸衍生途径 | TAT1 | 酪氨酸氨基转移酶 | 催化 | 表达下调 |
| Salvia miltiorrhiza hairy roots | 酪氨酸衍生途径 | HPPR1 | 羟苯基丙酮酸还原酶 | 催化 | 表达下调 |
| Salvia miltiorrhiza hairy roots | MEP途径 | DXS1 | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | 表达上调 |
| Salvia miltiorrhiza hairy roots | MEP途径 | DXR | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 | 催化 | 表达上调 |
| Salvia miltiorrhiza hairy roots | MEP途径 | MCT | 2C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶 | 催化 | 表达上调 |
| Salvia miltiorrhiza hairy roots | MEP途径 | HDR1 | 1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶 | 催化 | 表达上调 |
| Salvia miltiorrhiza hairy roots | 丹参酮下游生物合成途径 | GGPPS1 | 牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶 | 催化 | 表达上调 |
| Salvia miltiorrhiza hairy roots | 丹参酮下游生物合成途径 | CPS1 | 柯巴基二磷酸合酶 | 催化 | 表达上调 |
| Salvia miltiorrhiza hairy roots | 丹参酮下游生物合成途径 | KSL1 | 贝壳杉烯合酶类似蛋白 | 催化 | 表达上调 |
| Salvia miltiorrhiza hairy roots | 丹参酮下游生物合成途径 | CYP76AH1 | 细胞色素P450单加氧酶CYP76AH1 | 催化 | 表达上调 |
| Salvia miltiorrhiza hairy roots | 次生代谢调控 | SmMYB36 | R2R3-MYB转录因子SmMYB36 | 调控 | 转录因子，过表达促进丹参酮积累、抑制酚酸合成 |
关键发现
SmMYB36编码160个氨基酸，预测分子量为18 kDa，与NCBI中KF059390.1序列有98%同一性。SmMYB36定位于细胞核和细胞质，具有转录激活活性（酵母在0-20 mM 3AT下仍可生长）。过表达SmMYB36显著提高丹参酮积累（总丹参酮含量增加，可见红色加深），同时降低迷迭香酸、丹酚酸B、总酚和总黄酮含量。MEP途径基因（DXS1、DXS2、DXR、MCT、MDS、HDS、CMK、HDR1）及下游丹参酮基因（GGPPS1、CPS1、KSL1、CYP76AH1）表达显著上调，而苯丙烷途径（PAL1、C4H1、4CL2）和酪氨酸途径（TAT1、HPPR1）基因表达下调。脂肪酸分析显示总脂肪酸含量上升，油酸（C18:1）相对含量显著下降，亚油酸（C18:2）显著上升。EMSA表明SmMYB36能与C4H1、4CL2、HPPR1、DXR、MCT、GGPPS1等基因启动子中的MYB元件结合，也能与核心元件MBS1（CAACTG）、MBSI（AAAAAAC(C/G)GTTA）、MBSII（AAAAGTTAGTTA）直接互作。
研究结论
SmMYB36是丹参中一个可同时正向调控丹参酮积累、负向调控酚酸和类黄酮合成的内源R2R3-MYB转录因子。它通过调节多个代谢通路基因的转录，使代谢流从酚酸方向转向丹参酮方向，是丹参次生代谢工程的重要潜在工具。