High-fidelity de novo synthesis of pathways using microchip-synthesized oligonucleotides and general molecular biology equipment
- 作者
- Wen Wan, Min Lu, Dongmei Wang, Xiaolian Gao, Jiong Hong
- 杂志
- Scientific Reports（2017）
- DOI
- 10.1038/s41598-017-06428-0
- 所属领域
- 合成生物学 / 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
微芯片合成寡核苷酸池存在错误率高（2-10/kb）、浓度低、复杂度高，且现有纠错方法通量低、成本高或依赖专用设备，难以满足大规模、低成本、高保真的从头合成代谢通路的需求。
研究策略
采用整体寡核苷酸池扩增（MP-PCR）、基于MutS固定化纤维素柱（MICC）的高通量错误去除，以及多重LCR片段组装，将各步骤通量提高至整个寡核苷酸池（479个寡核苷酸），并结合Gibson组装构建代谢通路操纵子。
研究路线图
核心内容
研究人员开发了一种基于微芯片合成寡核苷酸的高通量、高保真DNA从头合成方法，并成功构建了大小为11.9 kb、编码10个基因的功能性番茄红素生物合成通路。该方法将寡核苷酸池扩增、MutS固定化纤维素柱纠错和多重连接酶链式反应片段组装三个步骤的通量分别提升至479个寡核苷酸、整个寡核苷酸池和36个片段每反应，成本降低18倍以上，且全程仅需常规分子生物学设备。未经纠错时，合成片段的错误率为14.25/kb，无错误片段比例仅3.23%；经两轮纠错（寡核苷酸阶段和片段阶段）后，错误率降至0.54/kb，无错误片段比例提升至81.48%。将合成的通路在dxr缺失的大肠杆菌WW-1菌株中表达后，细胞呈现红色，证实了通路功能正常。该策略为中低通量实验室提供了一种无需专用仪器即可快速合成和纠错代谢通路的可行方案，并可扩展至更大规模的基因合成。
创新点
['利用MP-PCR将寡核苷酸扩增通量从1个亚池提高到36个亚池（479个寡核苷酸）单反应。', '将MICC错误去除通量从10-32个寡核苷酸提高到479个寡核苷酸。', '将LCR片段组装通量提高到36个片段/反应（分两轮完成），成本降低18倍以上。', '整个流程仅需常规分子生物学设备（热循环仪）和商业微芯片寡核苷酸，无需昂贵专用仪器。']
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 番茄红素生物合成通路（异源） | crtE | geranylgeranyl pyrophosphate synthase | 催化 | 合成基因，催化GGPP生成 |
| Escherichia coli | 番茄红素生物合成通路（异源） | crtB | phytoene synthase | 催化 | 合成基因，催化八氢番茄红素合成 |
| Escherichia coli | 番茄红素生物合成通路（异源） | crtI | phytoene dehydrogenase | 催化 | 合成基因，催化脱氢生成番茄红素 |
| Escherichia coli | MVA途径（异源） | ispA | farnesyl diphosphate synthase | 催化 | 合成基因，生成FPP |
| Escherichia coli | MVA途径（异源） | mvaE | hydroxymethylglutaryl-CoA reductase | 催化 | 合成基因，MVA途径酶 |
| Escherichia coli | MVA途径（异源） | mvaS | hydroxymethylglutaryl-CoA synthase | 催化 | 合成基因，MVA途径酶 |
| Escherichia coli | MVA途径（异源） | mvaK1 | mevalonate kinase | 催化 | 合成基因，MVA途径酶 |
| Escherichia coli | MVA途径（异源） | mvaK2 | phosphomevalonate kinase | 催化 | 合成基因，MVA途径酶 |
| Escherichia coli | MVA途径（异源） | mvaD | diphosphomevalonate decarboxylase | 催化 | 合成基因，MVA途径酶 |
| Escherichia coli | MVA途径（异源） | idi | isopentenyl-diphosphate delta-isomerase | 催化 | 合成基因，IPP异构酶 |
| Escherichia coli | MEP途径（内源） | dxr | DXP reductoisomerase | 催化 | 内源基因，用于构建WW-1菌株时敲除，以评估异源途径功能 |
| Escherichia coli | DNA错误校正 | — | MutS | 调控 | 利用eMutS和tMutS制作固定化纤维素柱（MICC），用于去除合成DNA中的错配 |
关键发现
- 构建了大小为11.9 kb、编码10个基因的功能性番茄红素生物合成通路
- 未经纠错时错误率为14.25/kb（448 errors/31445 bp），无错误片段比例仅3.23%
- 经低通量MICC纠错后错误率降至2.08/kb（6.58倍改善），无错误片段比例升至48.44%
- 采用高通量整体池纠错后错误率为2.20/kb（6.48倍改善），无错误片段比例41.51%
- 多重组装后错误率降至1.85/kb（7.70倍改善），无错误片段比例55.5%
- 经两轮纠错（寡核苷酸和片段阶段）后错误率进一步降至0.54/kb（26倍以上改善），无错误片段比例达81.48%。在dxr缺失的大肠杆菌WW-1菌株中表达合成通路后细胞呈红色，证明通路功能正常。
研究结论
本研究建立了一种利用微芯片合成寡核苷酸进行高通量、高保真、低成本的从头DNA合成方法，通过MP-PCR扩增整池、MICC高通量纠错和多重LCR组装，可在常规分子生物学实验室中快速合成代谢通路，并可扩展至更大规模的基因合成。