Comprehensive transcriptome profiling of Salvia miltiorrhiza for discovery of genes associated with the biosynthesis of tanshinones and phenolic acids
- 作者
- Wei Zhou, Qiang Huang, Xiao Wu, Zewen Zhou, Mingquan Ding, Min Shi, Fenfen Huang, Shen Li, Yao Wang, Guoyin Kai
- 杂志
- Scientific Reports（2017）
- DOI
- 10.1038/s41598-017-10215-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析丹参毛状根中丹参酮和酚酸生物合成的下游关键基因及调控因子，揭示甲基茉莉酸甲酯（MeJA）与酵母提取物（YE）诱导产生不同代谢物谱的分子机制。
研究策略
对MeJA或YE处理的丹参毛状根进行转录组测序（RNA-seq），从头组装unigenes，通过差异表达分析、共表达网络分析筛选候选P450、下游氧化还原酶及转录因子，并用qRT-PCR和HPLC验证。
研究路线图
核心内容
本研究对甲基茉莉酸甲酯（MeJA）或酵母提取物（YE）处理的丹参毛状根进行转录组测序，从头组装获得55,588个unigenes，其中76.4%获得功能注释。差异表达分析显示MeJA和YE分别诱导5,767个和4,482个unigenes显著上调。HPLC检测表明，YE处理使总丹参酮含量最大提高4.47倍，而MeJA处理提高1.94倍；MeJA使总酚酸含量最大提高0.56倍，YE则无显著诱导作用。通过共表达网络分析，筛选出45个MeJA响应和27个YE响应的P450候选基因，以及375个上调转录因子（其中WRKY 59个、bHLH 51个、MYB 38个）。qRT-PCR验证了12个丹参酮合成基因和7个酚酸合成基因的表达，与RNA-seq数据相关系数达0.932-0.979。此外还发现7个ZSD1样脱氢酶和6个DBR2样还原酶等候选基因。该转录组数据为丹参酮和酚酸生物合成下游催化酶与上游调控因子的功能鉴定提供了丰富基因资源，有助于阐明两种诱导子介导的不同生物合成调控机制。
创新点
系统比较MeJA与YE两种诱导子的转录组差异；结合共表达分析筛选出45个MeJA响应和27个YE响应的P450基因及375个上调转录因子；为丹参酮和酚酸下游生物合成基因的发掘提供了丰富基因资源。
研究对象（26）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成（MEP途径） | DXS | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶 | 催化 | MEP途径第一个关键酶 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成（MEP途径） | DXR | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 | 催化 | — |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成（MVA途径） | HMGR | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | MVA途径关键酶 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成（MVA途径） | HMGS | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶 | 催化 | — |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成（MVA/MEP下游） | FPPS | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | — |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成（MVA/MEP下游） | GGPPS | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 | 催化 | — |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成（下游环化） | CPS1 | 柯巴基焦磷酸合酶 | 催化 | 催化GGPP环化生成柯巴基焦磷酸 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成（下游环化） | KSL | 类贝壳杉烯合酶 | 催化 | 参与次丹参酮二烯等中间体形成 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成（下游氧化） | CYP76AH1 | 细胞色素P450单加氧酶CYP76AH1 | 催化 | 催化militradiene氧化生成ferruginol |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成（下游氧化） | CYP76AH3 | 细胞色素P450单加氧酶CYP76AH3 | 催化 | 参与丹参酮下游氧化步骤 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 酚酸生物合成（苯丙烷途径） | PAL | 苯丙氨酸解氨酶 | 催化 | — |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 酚酸生物合成（苯丙烷途径） | C4H | 肉桂酸-4-羟化酶 | 催化 | — |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 酚酸生物合成（苯丙烷途径） | 4CL | 4-香豆酸辅酶A连接酶 | 催化 | — |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 酚酸生物合成（酪氨酸衍生途径） | TAT | 酪氨酸氨基转移酶 | 催化 | — |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 酚酸生物合成（酪氨酸衍生途径） | HPPR | 对羟基苯丙酮酸还原酶 | 催化 | — |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 酚酸生物合成（下游缩合） | RAS | 迷迭香酸合酶 | 催化 | 催化咖啡酰辅酶A与4-羟基苯乳酸缩合 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 酚酸生物合成（下游羟化） | CYP98A14 | 细胞色素P450单加氧酶CYP98A14 | 催化 | 催化迷迭香酸途径中3-羟基化反应 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 酚酸生物合成（二聚化） | Laccase | 漆酶 | 催化 | 候选催化迷迭香酸二聚化生成丹酚酸B |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成（下游氧化还原） | ZSD1-like dehydrogenase | 短链脱氢酶 | 催化 | 候选脱氢酶，与丹参酮下游脱氢步骤相关 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成（下游氧化还原） | DBR2-like reductase | 醛Δ11(13)还原酶 | 催化 | 候选还原酶，可能参与丹参酮双键还原 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮/酚酸生物合成调控 | WRKY | WRKY转录因子 | 调控 | 59个上调，YE诱导较多 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮/酚酸生物合成调控 | MYB | MYB转录因子 | 调控 | 38个上调，MeJA诱导较多 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮/酚酸生物合成调控 | bHLH | bHLH转录因子 | 调控 | 51个上调，MeJA诱导较多 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮/酚酸生物合成调控 | AP2-EREBP | AP2/EREBP转录因子 | 调控 | 28个上调，MeJA诱导较多 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮/酚酸生物合成调控 | NAC | NAC转录因子 | 调控 | 主要上调家族之一 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮/酚酸生物合成调控 | GRAS | GRAS转录因子 | 调控 | 2个上调 |
关键发现
- 共获得约1.73亿条clean reads，组装出55,588个unigenes，其中42,458个（76.4%）获得功能注释。MeJA诱导下5,767个unigenes显著上调，YE诱导下4,482个unigenes上调。HPLC检测显示，YE处理使总丹参酮含量最大提高4.47倍，MeJA处理提高1.94倍
- MeJA使总酚酸含量最大提高0.56倍，而YE对酚酸无显著诱导。qRT-PCR验证12个丹参酮合成基因和7个酚酸合成基因的表达与RNA-seq数据一致，相关系数达0.932-0.979。共鉴定出66个unigenes编码26个丹参酮合成酶、37个unigenes编码17个酚酸合成酶
- 筛选出45个MeJA响应和27个YE响应的P450候选基因。共375个转录因子上调表达，其中WRKY 59个、bHLH 51个、MYB 38个、AP2-EREBP 28个、GRAS 2个。此外，发现7个ZSD1样脱氢酶、6个DBR2样还原酶、4个Laccase1A和3个Laccase2候选基因，可能参与丹参酮和酚酸下游步骤。
研究结论
该转录组数据为丹参酮和酚酸生物合成的下游催化酶与上游调控因子的功能鉴定提供了重要基因资源，有助于阐明MeJA和YE介导的不同生物合成调控机制。