Engineering an aldehyde dehydrogenase toward its substrates, 3-hydroxypropanal and NAD+, for enhancing the production of 3-hydroxypropionic acid
- 作者
- Ye Seop Park, Un Jong Choi, Nguyen Hoai Nam, Sang Jin Choi, Abdul Nasir, Sun-Gu Lee, Kyung Jin Kim, Gyoo Yeol Jung, Sangdun Choi, Jeung Yeop Shim, Sunghoon Park, Tae Hyeon Yoo
- 杂志
- Scientific Reports（2017）
- DOI
- 10.1038/s41598-017-15400-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
3-羟基丙酸（3-HP）生物生产中，中间产物3-羟基丙醛（3-HPA）的毒性以及NAD+再生效率低是主要瓶颈；现有醛脱氢酶（ALDH）对底物3-HPA和NAD+的活性不足，导致3-HPA积累和细胞死亡。
研究策略
对来自巴西固氮螺菌的α-酮戊二酸半醛脱氢酶（KGSADH）进行定向进化：基于同源模型和晶体结构，对3-HPA和NAD+结合口袋的氨基酸残基进行随机突变（NNK简并密码子），构建突变体库并筛选高活性变体；随后在重组假单胞菌中验证改良酶的3-HP生产性能。
研究路线图
核心内容
本研究针对3-羟基丙酸生物合成中3-羟基丙醛毒性及NAD+再生效率低的瓶颈，对来源于巴西固氮螺菌的α-酮戊二酸半醛脱氢酶进行定向进化。作者基于同源模型和晶体结构，对3-HPA和NAD+两个底物结合口袋的关键残基进行NNK随机突变，构建突变体库并筛选高活性变体，随后在重组脱氮假单胞菌中验证其生产性能。获得的最佳变体108-QR对3-HPA的Km由野生型的1.6 mM降至0.17 mM，对NAD+的Km由0.21 mM降至0.037 mM，催化效率分别提升约4倍和3倍；同时该变体对NADH的抑制作用明显减弱，在3 mM NADH下仍保留约60%活性，且对3-HPA灭活的半衰期较野生型提高至少50%。在重组菌摇瓶发酵中，含108-QR的菌株24小时3-HP产量达53 mM，较野生型提高约40%，3-HPA积累降低约50%，细胞生长OD600由1.6提升至2.1。研究发现NAD+结合口袋的R334Q/A337R双突变意外改变了醛底物结合口袋的构象，提高了底物特异性。该策略有效缓解了3-HPA毒性和NAD+再生问题，但变体的kcat和热稳定性有所下降，仍需进一步优化。
创新点
1) 首次系统改造KGSADH的两个底物结合口袋，同时降低对3-HPA和NAD+的Km；2) 发现NAD+结合口袋的R334Q/A337R双突变意外改变醛底物结合口袋构象，提高底物特异性；3) 得到的108-QR变体在重组菌中显著提高3-HP产量并降低3-HPA积累。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH10β | 3-HP生物合成（甘油途径） | kgsadh | KGSADH（野生型及变体） | 催化 | 用于KGSADH表达、突变体库筛选和酶纯化 |
| Pseudomonas denitrificans Δ3hpdH Δ3hbdhIV | 甘油→3-HP途径 | dhaB, gdrAB, kgsadh | DhaB, GdrAB, KGSADH（108-QR或野生型） | 催化 | 用于3-HP的摇瓶生产，DhaB催化甘油脱水，KGSADH催化3-HPA氧化，GdrAB辅助DhaB再激活 |
| Azospirillum brasilense | α-酮戊二酸半醛代谢 | kgsadh | KGSADH | 催化 | 目标酶来源，催化3-HPA氧化为3-HP |
| — | 甘油脱水 | dhaB | DhaB | 催化 | 甘油脱水酶，将甘油转化为3-HPA；在P. denitrificans中表达 |
| — | 甘油脱水（辅助） | gdrAB | GdrAB | 调控 | DhaB的再激活因子，保护DhaB活性 |
关键发现
- 通过随机突变和筛选获得的KGSADH变体显著降低了对3-HPA和NAD+的Km：108-QR对3-HPA的Km为0.17 mM（野生型为1.6 mM，降低约9.4倍），对NAD+的Km为0.037 mM（野生型为0.21 mM，降低约5.7倍）
- kcat/Km(3-HPA)由野生型的9 s^-1 mM^-1增至35 s^-1 mM^-1，kcat/Km(NAD+)由57增至165 s^-1 mM^-1。WT-QR（仅含R334Q/A337R）的Km(3-HPA)为0.55 mM，Km(NAD+)为0.044 mM。变体对NADH的抑制作用减弱：在3 mM NADH下仍保留约60%活性，而野生型呈线性抑制
- 变体对3-HPA灭活的半衰期比野生型至少提高50%。重组P. denitrificans（含108-QR）摇瓶发酵24 h的3-HP产量为53 mM，较野生型（37 mM）提高约40%
- 3-HPA积累降低约50%
- 细胞生长OD600为2.1（野生型1.6）。所有变体对3-HP（1 M）和NADH的产物抑制均低于野生型。
研究结论
通过定向进化获得的KGSADH变体（尤其是108-QR）显著降低了对3-HPA和NAD+的Km，提高了底物特异性，降低NADH抑制和3-HPA失活，在重组P. denitrificans中提高3-HP产量约40%，为缓解3-HPA毒性和NAD+再生问题提供了有效策略；但变体kcat和热稳定性有所下降，仍需进一步优化。