CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of the dihydroflavonol-4-reductase-B (DFR-B) locus in the Japanese morning glory Ipomoea (Pharbitis) nil
- 作者
- Kenta Watanabe, Anna Kobayashi, Masaki Endo, Kimiyo Sage-Ono, Seiichi Toki, Michiyuki Ono
- 杂志
- Scientific Reports（2017）
- DOI
- 10.1038/s41598-017-10715-1
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
将CRISPR/Cas9靶向诱变技术应用于日本牵牛花（Ipomoea nil），实现对花青素合成基因DFR-B的定点敲除，并观察花色改变，为园艺植物基因功能研究和育种提供新工具。
研究策略
以花青素合成关键酶基因DFR-B为靶点，设计特异性sgRNA，构建含Cas9、sgRNA及NPTII筛选标记的all-in-one植物表达载体，通过农杆菌介导转化日本牵牛花次生胚，利用茎色表型变化、CAPS分析和DNA测序筛选突变体，并分析后代表型和脱靶情况。
研究路线图
核心内容
该研究将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于日本牵牛花（Ipomoea nil），以花青素合成关键酶基因DFR-B为靶点，通过农杆菌介导转化次生胚，实现了对该基因的高效定点敲除。研究中构建了含Cas9、特异性sgRNA及NPTII筛选标记的all-in-one载体，利用茎色表型变化、CAPS分析和DNA测序筛选突变体。在32个转基因T1植株中，24个（75%）表现为花青素缺失的白色花，携带双等位突变，总突变率达84%；突变类型包括1 bp插入和2~98 bp的缺失。周缘嵌合体比例为6%（2/32），其中一株携带98 bp大片段缺失。对9个潜在脱靶位点测序均未发生突变，证实了编辑的特异性。T2代分析显示，双等位突变体#9-1的后代24株均表现绿茎，部分植株不含T-DNA，表明突变与T-DNA未共分离，获得了稳定遗传的无转基因突变后代。该工作首次在高等植物中利用CRISPR/Cas9实现花色改变，证明该技术可单代内获得双等位突变体，为牵牛花及其他园艺植物的基因功能研究和精准育种提供了高效、特异且对公众更易接受的新途径。
创新点
['首次在高等植物中利用CRISPR/Cas9技术实现花色改变', '在牵牛花中高效获得双等位基因突变体（75%，24/32）', '验证了PAM序列对CRISPR/Cas9靶向特异性的必要性，无脱靶突变', '获得无T-DNA插入的纯合突变后代，属于产物而非过程意义上的非转基因植物']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Ipomoea nil (日本牵牛花) cv. Violet | 花青素生物合成途径 | InDFR-B (AB006793) | Dihydroflavonol-4-reductase-B (DFR-B) | 催化 | 靶标基因，编码花青素生物合成中的二氢黄酮醇-4-还原酶，其功能缺失导致花和茎无色素 |
| Ipomoea nil (日本牵牛花) cv. Violet | 花青素生物合成途径 | InDFR-A | Dihydroflavonol-4-reductase-A (DFR-A) | 催化 | DFR-B的同源基因，与sgRNA有19/20匹配但缺少PAM，未检测到突变 |
| Ipomoea nil (日本牵牛花) cv. Violet | 花青素生物合成途径 | InDFR-C | Dihydroflavonol-4-reductase-C (DFR-C) | 催化 | DFR-B的同源基因，与sgRNA有18/20匹配但缺少PAM，未检测到突变 |
| Ipomoea nil (日本牵牛花) cv. Violet | — | Cas9 (Streptococcus pyogenes) | Cas9核酸内切酶 | 催化 | CRISPR/Cas9系统的核心核酸酶，由拟南芥密码子优化的FFCas9表达，受PcUbi-4-2启动子驱动 |
| Ipomoea nil (日本牵牛花) cv. Violet | — | NPTII | Neomycin phosphotransferase II | 催化 | 卡那霉素抗性选择标记，用于筛选转基因植株 |
关键发现
- 在32个转基因T1植株中，24个（75%）表现为花青素缺失的白色花，并携带DFR-B位点的双等位突变
- 突变类型包括1 bp插入和2~98 bp的缺失
- 总突变率为84%（27/32），双等位突变率约为31%（10/32，以CAPS分析为准）
- 6%（2/32）的植株为周缘嵌合体（#8-1为L2层嵌合，#36-2为L1层嵌合），其中#36-2携带98 bp的大片段缺失
- 9个潜在脱靶位点经测序均未发生突变
- T2代中，双等位突变体#9-1的后代24株均表现绿茎，其中部分植株不含T-DNA，表明突变和T-DNA未共分离。
研究结论
CRISPR/Cas9系统可高效、特异地在日本牵牛花中实现靶向突变，且可在单代内获得双等位突变体和稳定遗传的突变后代。该技术为I. nil及其他园艺植物的基因功能研究和精准育种提供了有效途径，所获得的无转基因突变体有助于增进公众对新型植物育种技术的理解。