Structure-guided design of Serratia marcescens short-chain dehydrogenase/reductase for stereoselective synthesis of (R)-phenylephrine
- 作者
- Jai-Shin Liu, Yi-Chia Kuan, Yu Tsou, Tung-Yueh Lin, Wen-Hwei Hsu, Ming-Te Yang, Jong-Yih Lin, Wen-Ching Wang
- 杂志
- Scientific Reports（2018）
- DOI
- 10.1038/s41598-018-19235-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
SmSDR催化HPMAE还原为(R)-苯福林时转化率较低，需通过结构解析和理性设计提高酶活性与生物转化效率。
研究策略
解析SmSDR的apo和NADPH结合晶体结构，结合分子对接模拟底物结合模式，对柔性环上的Phe98和Phe202等位点进行定点突变，筛选出活性提高的变体。
核心内容
本研究以Serratia marcescens来源的短链脱氢酶/还原酶（SmSDR）为对象，针对其在催化HPMAE不对称还原生成(R)-苯福林时转化率偏低的问题，采用结构引导的定点突变策略进行酶工程改造。研究人员首先解析了SmSDR的apo（1.47 Å）及NADPH结合态晶体结构，结合分子对接分析底物结合模式，锁定底物口袋柔性臂上Phe98和Phe202两个关键残基，构建了多个定点突变体。结果显示，双突变体F98YF202L在整细胞转化中(R)-苯福林产量达3.35 mM，为野生型（2.13 mM）的1.57倍；F98Y及F98YF202Y的热稳定性亦显著提升，ΔTm分别达2.08°C和1.28°C，其中F98YF202Y突变体在Tyr98与Tyr202间形成3.10 Å的氢键，有助于稳固柔性区域。动力学分析表明突变体Km略有下降而kcat/Km基本持平。该研究证实了通过稳定底物结合口袋柔性构象可有效提升SmSDR的不对称合成效率，为(S)-苯福林手性前体的生物催化制备提供了可供借鉴的理性设计思路，其中F98YF202L为最具应用潜力的工程酶变体。
创新点
['首次解析SmSDR及其突变体的高分辨率晶体结构', '发现Phe98-Phe202疏水簇对稳定底物口袋柔性臂的关键作用', '通过结构引导设计获得转化率提高1.57倍的F98YF202L变体']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 脂肪酸生物合成/生物转化合成(R)-苯福林 | sdr | SmSDR（野生型） | 催化 | 来自Serratia marcescens BCRC 10948，天然催化3-氧酰基-ACP还原，也可还原HPMAE生成(R)-PE |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 生物转化合成(R)-苯福林 | sdr（F98Y突变） | SmSDR-F98Y | 催化 | 提高热稳定性（ΔTm+2.08°C），PE产量3.05 mM |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 生物转化合成(R)-苯福林 | sdr（F98Y/F202L突变） | SmSDR-F98YF202L | 催化 | 最佳变体，PE产量3.35 mM，为野生型1.57倍 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 生物转化合成(R)-苯福林 | sdr（F98Y/F202Y突变） | SmSDR-F98YF202Y | 催化 | 引入Tyr98-Tyr202氢键，PE产量2.84 mM |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 生物转化合成(R)-苯福林 | sdr（A42S突变） | SmSDR-A42S | 催化 | 模拟SeOACPR的辅因子结合，PE产量2.86 mM（1.34倍） |
关键发现
- 解析了SmSDR apo结构（1.47 Å）及突变体结构
- F98YF202L在整细胞转化中PE产量达3.35 mM，为野生型2.13 mM的1.57倍
- F98Y和F98YF202Y热稳定性提高（ΔTm分别为2.08°C和1.28°C）
- F98YF202Y在Tyr98与Tyr202间形成3.10 Å氢键
- A42S变体产量2.86 mM（1.34倍）
- 动力学参数显示变体Km略有下降但kcat/Km相近。
研究结论
结构引导的定点突变通过稳定SmSDR底物结合口袋的柔性区域，显著提高了不对称合成(R)-苯福林的转化能力，其中F98YF202L是最有价值的工程变体。