Development of a high-throughput assay for rapid screening of butanologenic strains
- 作者
- Chidozie Victor Agu, Stella M. Lai, Victor Ujor, Pradip K. Biswas, Andy Jones, Venkat Gopalan, Thaddeus Chukwuemeka Ezeji
- 杂志
- Scientific Reports（2018）
- DOI
- 10.1038/s41598-017-18074-7
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
现有基于酿酒酵母乙醇脱氢酶(Sc ADH)的比色法在ABE发酵液中测定丁醇时受到乙醇干扰，无法特异性定量丁醇，需要开发一种能优先利用丁醇的高通量测定方法以筛选高产丁醇菌株。
研究策略
从文献中筛选出Thermotoga hypogea (Th) ADH，其优先利用丁醇而非乙醇；克隆表达纯化重组Th ADH，建立基于NADPH吸光度(340 nm)的微量滴定板高通量终点测定法，并应用于代谢工程改造的Clostridium beijerinckii菌株筛选。
研究路线图
核心内容
针对现有基于酿酒酵母乙醇脱氢酶的丁醇比色法受乙醇严重干扰的问题，本研究从嗜热菌Thermotoga hypogea中筛选并重组表达了优先利用丁醇的乙醇脱氢酶（Th ADH），建立了基于NADPH在340 nm吸光度的96孔板高通量终点测定法。酶动力学显示，Th ADH对丁醇的催化效率（6.94 min⁻¹mM⁻¹）是对乙醇的6倍，且Km值（丁醇34.1 mM对乙醇198 mM）差异显著；在丁醇与乙醇比例不低于2.6:1时，乙醇不干扰测定，丙酮、乙酸和丁酸等ABE发酵副产物也无影响。利用该方法测定三株拜氏梭菌发酵样品的丁醇浓度（8.4、6.1、7.6 g/L），与气相色谱结果（8.1、6.4、7.2 g/L）高度一致，并成功筛选出24个重组菌落中多个丁醇产量达约12 g/L的菌株。该高通量方法可快速准确筛选梭菌突变文库，为丁醇代谢工程提供了高效工具。
创新点
首次利用Th ADH开发特异性检测丁醇的高通量分光光度法，避免乙醇干扰；该测定法对ABE发酵产物(丙酮、乙酸、丁酸)不敏感，并成功适配96孔板格式，实现快速筛选。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21 (DE3) Rosetta | 异源蛋白表达 | Th ADH | Thermotoga hypogea alcohol dehydrogenase | 催化 | 重组表达用于丁醇定量测定 |
| Saccharomyces cerevisiae | 酒精代谢 | ADH | Sc alcohol dehydrogenase | 催化 | 商业酶，作为对照，显示对乙醇偏好 |
| Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 | ABE发酵 | dhaD1 | 甘油脱氢酶 (GDH) | 催化 | 来自Clostridium pasteurianum，过表达以增强甘油利用和NADPH再生 |
| Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 | ABE发酵 | gldA1 | 甘油脱氢酶 (GDH) | 催化 | 来自Clostridium pasteurianum，与dhaD1融合表达 |
| Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 | ABE发酵 | dhaK | 二羟丙酮激酶 (DHAK) | 催化 | 来自Clostridium pasteurianum，磷酸化DHA生成DHAP |
关键发现
- Sc ADH对乙醇的催化效率(54±3 min⁻¹mM⁻¹)约为丁醇(4.3±1.2 min⁻¹mM⁻¹)的13倍
- Th ADH_ae对丁醇的催化效率(6.94±0.3 min⁻¹mM⁻¹)是乙醇(1.13±0.05 min⁻¹mM⁻¹)的6倍，Km丁醇(34.1±0.6 mM)比乙醇(198±8.9 mM)低6倍
- 在丁醇:乙醇≥2.6:1时乙醇不干扰Th ADH测定
- ABE发酵产物不干扰
- 用Th ADH_ae测定3个Cb发酵样品的丁醇浓度(8.4、6.1、7.6 g/L)与气相色谱结果(8.1、6.4、7.2 g/L)接近
- 利用高通量测定筛选24个重组Cb菌落，其中B、C、G、J、K、L、Q、T、X菌落丁醇产量达12 g/L左右。
研究结论
开发了基于重组Th ADH的稳健高通量分光光度测定法，可直接准确测量微生物培养物中的丁醇浓度，不受其他主要ABE发酵产物影响，在丁醇:乙醇>2.6时乙醇不干扰，可用于快速筛选溶剂性梭菌突变文库，促进丁醇代谢工程研究。