Molecular dissection of transcriptional reprogramming of steviol glycosides synthesis in leaf tissue during developmental phase transitions in Stevia rebaudiana Bert
- 作者
- Gopal Singh, Gagandeep Singh, Pradeep Singh, Rajni Parmar, Navgeet Paul, Radhika Vashist, Mohit Kumar Swarnkar, Ashok Kumar, Sanatsujat Singh, Anil Kumar Singh, Sanjay Kumar, Ram Kumar Sharma
- 单位
- CSIR-Institute of Himalayan Bioresource Technology (IHBT); Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR); Department of Biotechnology, 印度部分未明确; 具体单位请以原文为准
- 杂志
- Scientific Reports（2017）
- DOI
- 10.1038/s41598-017-12025-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析甜叶菊叶片发育阶段转变过程中，萜类合成途径中甜菊糖苷(SGs)与赤霉素(GAs)分支之间的转录调控机制，明确影响SGs积累的关键基因与调控因子。
研究策略
对营养期(LV)、现蕾期(LB)和开花期(LF)叶片进行Illumina GAIIx转录组测序，de novo组装后通过差异表达分析、qRT-PCR验证、KEGG注释、转录因子鉴定以及基于拟南芥的蛋白质互作(PPI)网络分析，系统解析SGs/GAs合成通路的发育阶段依赖性表达变化。
研究路线图
核心内容
该研究对甜叶菊营养期、现蕾期和开花期三个发育阶段的叶片进行转录组测序，通过de novo组装获得41,262条转录本，系统解析了甜菊糖苷与赤霉素合成分支在发育转变中的转录调控机制。结果显示，甜菊糖苷合成关键基因HMGR、DXS、KA13H及UGT 85C2、UGT 74G1、UGT 76G1在营养期表达量最高，随发育推进逐渐下降；而赤霉素合成相关基因KAO、GA20O、GA3O则在开花期表达上调，表明代谢流在发育过程中发生从甜菊糖苷向赤霉素的协调切换。研究还鉴定出124个细胞色素P450和45个UGT，以及分属58个家族的8,888个转录因子转录本，其中MYB家族数量最多。蛋白质互作网络分析揭示AACT和HMGS分别与64和25个蛋白互作，多个UGT和CYP（如UGT 92A1、CYP 71A22）处于网络核心位置。差异表达分析显示营养期与开花期之间差异基因达5,380个，其中3,456个在营养期上调。该研究从转录水平揭示了发育阶段转变导致甜菊糖苷含量下降的分子机制，为甜叶菊分子育种提供了HMGR、DXS、KA13H及MYB/bHLH等关键候选靶点。
创新点
1. 首次在转录水平系统解析甜叶菊发育阶段转变对SGs生物合成的影响；2. 鉴定出124个CYPs和45个UGTs，丰富了基因组资源；3. 通过PPI网络分析发现多个潜在核心蛋白(如UGT 92A1、CYP 71A22)与SGs/GAs代谢通路的关联；4. 提出HMGR、DXS、KA13H及MYB/bHLH/WRKY/NAC等转录因子是调控SGs积累的关键候选靶点。
研究对象（28）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Stevia rebaudiana Bert (甜叶菊, CSIR-IHBT-ST-04) | MVA(胞质)途径 | HMGR | HMG-CoA还原酶 | 催化 | MVA途径限速酶，营养期表达量最高 |
| Stevia rebaudiana Bert | MEP(质体)途径 | DXS | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | MEP途径限速酶，营养期高表达 |
| Stevia rebaudiana Bert | SGs/GAs共同上游途径 | GGPPS | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 | 催化 | 催化IPP/DMAPP聚合生成GGPP，各阶段表达相近 |
| Stevia rebaudiana Bert | SGs/GAs共同途径 | CPPS | ent-柯巴基焦磷酸合酶 | 催化 | 营养期表达高于现蕾和开花期 |
| Stevia rebaudiana Bert | SGs/GAs共同途径 | KS | ent-贝壳杉烯合酶 | 催化 | 各阶段表达相似 |
| Stevia rebaudiana Bert | SGs/GAs共同途径 | KO | ent-贝壳杉烯氧化酶 (CYP701A3) | 催化 | 各阶段表达相似 |
| Stevia rebaudiana Bert | 甜菊糖苷合成分支 | KA13H | ent-贝壳杉烯酸13-羟化酶 | 催化 | 营养期高表达，促进steviol生成 |
| Stevia rebaudiana Bert | 赤霉素合成分支 | KAO | ent-贝壳杉烯酸氧化酶 (CYP88A3) | 催化 | 生殖期高表达，分流至GA12合成 |
| Stevia rebaudiana Bert | 甜菊糖苷合成分支 | UGT 85C2 | UDP-糖基转移酶85C2 | 催化 | 营养期高表达，参与steviol糖基化 |
| Stevia rebaudiana Bert | 甜菊糖苷合成分支 | UGT 74G1 | UDP-糖基转移酶74G1 | 催化 | 营养期高表达 |
| Stevia rebaudiana Bert | 甜菊糖苷合成分支 | UGT 76G1 | UDP-糖基转移酶76G1 | 催化 | 营养期高表达 |
| Stevia rebaudiana Bert | 赤霉素合成分支 | GA20O | 赤霉素20-氧化酶 | 催化 | 现蕾和开花期表达较高 |
| Stevia rebaudiana Bert | 赤霉素合成分支 | GA3O | 赤霉素3-氧化酶 | 催化 | 现蕾和开花期表达较高 |
| Stevia rebaudiana Bert | 转录调控 | MYB家族 | MYB转录因子 | 调控 | 共1053个转录本，最多家族，可能调控SGs合成 |
| Stevia rebaudiana Bert | 转录调控 | bHLH家族 | bHLH转录因子 | 调控 | 共681个转录本，参与光周期信号等 |
| Stevia rebaudiana Bert | 转录调控 | WRKY家族 | WRKY转录因子 | 调控 | 参与次生代谢和胁迫响应 |
| Stevia rebaudiana Bert | 转录调控 | NAC家族 | NAC转录因子 | 调控 | 共515个转录本，参与发育和胁迫 |
| Stevia rebaudiana Bert | 次生代谢多样化 | CYP 71A22 | 细胞色素P450 71A22 | 催化 | 与KAO互作，在现蕾/开花期高表达，可能促进GAs合成 |
| Stevia rebaudiana Bert | 次生代谢多样化 | UGT 92A1 | UDP-糖基转移酶92A1 | 催化 | 与UGT 85C2互作，营养期高表达，可能参与SGs合成 |
| Stevia rebaudiana Bert | 次生代谢多样化 | CYP 98A3 | 细胞色素P450 98A3 | 催化 | 营养期高表达，参与肉桂酸羟化，保护营养组织 |
| Stevia rebaudiana Bert | 次生代谢多样化 | CYP 77A1 | 细胞色素P450 77A1 | 催化 | 营养期高表达，与花青素合成相关 |
| Stevia rebaudiana Bert | 激素代谢 | CYP 707A2 | ABA 8'-羟化酶 | 催化 | 生殖期高表达，参与ABA分解，促进花期转变 |
| Stevia rebaudiana Bert | MVA途径 | AACT | 乙酰CoA乙酰转移酶 | 催化 | PPI网络中有64个互作邻居，可能为代谢枢纽 |
| Stevia rebaudiana Bert | MVA途径 | HMGS | HMG-CoA合酶 | 催化 | PPI网络中有25个互作邻居 |
| Stevia rebaudiana Bert | MEP途径 | DXR | 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶 | 催化 | 参与MEP途径，未作详细表达分析 |
| Stevia rebaudiana Bert | 运输/糖基化 | UGT 74D1 | UDP-糖基转移酶74D1 | 催化 | 营养期高表达，参与生长素糖基化 |
| Stevia rebaudiana Bert | 运输/糖基化 | UGT 74E2 | UDP-糖基转移酶74E2 | 催化 | H2O2诱导，参与吲哚丁酸糖基化，营养期高表达 |
| Stevia rebaudiana Bert | 细胞周期 | UGT 85A2 | UDP-糖基转移酶85A2 | 催化 | 在活跃分裂细胞中高表达，现蕾/开花期较高 |
关键发现
- 获得101,600,848条原始读段，过滤后82,293,555条用于组装，得到41,262个转录本，平均长度922 bp、N50为1,244 bp、GC含量39.3%；reads比对率86.82%，EST比对率95.71%。
- 鉴定出参与SGs/GAs生物合成的全部已知基因(除一个未知UGT外)。
- HMGR、DXS、KA13H、UGT 85C2、UGT 74G1、UGT 76G1在营养期(LV)表达量最高，随发育推进(现蕾、开花)表达下降；而GAs合成相关基因(KAO、GA20O、GA3O)在开花期表达更高。
- 差异表达基因数量：LV vs LB为4,274个，LV vs LF为5,380个，LB vs LF为3,498个；LV vs LF中3,456个在LV上调，仅1,824个在LF上调；LB vs LF中2,637个在LB上调，861个在LF上调。
- 鉴定到8,888个转录因子转录本，分属58个家族，其中MYB家族最多(1,053个)，其次bHLH(681个)、MYB-related(577个)、NAC(515个)。
- PPI网络分析显示183个Stevia直系同源蛋白与637个节点、2153条边互作，平均邻居数6.760，聚类系数0.484；AACT和HMGS分别有64和25个邻居，KA13H有6个邻居，KAO有8个邻居，UGT 85C2有3个邻居，UGT 76G1有2个邻居。
研究结论
甜叶菊叶片中SGs和GAs合成通量在发育阶段发生协调切换：营养期高表达SGs合成关键基因(KA13H、UGTs等)以促进甜菊糖苷积累，生殖期上调GAs合成基因(KAO、GA20O等)将代谢流转向赤霉素，从而导致开花期SGs含量下降。HMGR、DXS、KA13H及多种转录因子和细胞色素P450/UGT酶是调控这一过程的核心候选因子，为甜叶菊分子育种和遗传改良提供了重要基因组资源与靶点。