Theoretical Study of Sesterfisherol Biosynthesis: Computational Prediction of Key Amino Acid Residue in Terpene Synthase
- 作者
- Hajime Sato, Koji Narita, Atsushi Minami, Mami Yamazaki, Chao Wang, Hironori Suemune, Shingo Nagano, Takeo Tomita, Hideaki Oikawa, Masanobu Uchiyama
- 杂志
- Scientific Reports（2018）
- DOI
- 10.1038/s41598-018-20916-x
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
阐明sesterfisherol生物合成中的环化顺序（Path a vs Path b），并鉴定关键的氨基酸残基及其作用机制。
研究策略
采用DFT计算、AFIR方法和反应路径分析，结合同源建模、分子对接和定点突变实验，综合预测和验证环化路径。
核心内容
本研究通过密度泛函理论计算结合定点突变实验，系统阐明了芝田硫化叶菌萜类合酶NFSS催化sesterfisherol生物合成的环化机制。计算结果表明Path a（A-D-B/C环化顺序）与Path b在能量上均可行，但体外实验证实NFSS实际经Path a催化反应，其中D环形成活化能为13.3 kcal/mol。通过同源建模和分子对接，研究人员鉴定出关键残基F191，发现其通过C-H-π相互作用显著降低1,2-氢迁移的能垒并稳定碳正离子中间体。构建的F191A突变体完全丧失sesterfisherol合成能力，转而产生两种新骨架sesterterpenes（化合物2产量0.18 mg/L，化合物3产量0.04 mg/L），证实该残基对产物特异性具有决定性作用。研究首次将计算预测与实验验证相结合，精确定位了萜类合酶中控制环化路径的关键氨基酸，揭示了非共价相互作用在碳正离子化学中的重要性，为其他萜类合酶机制的理性设计提供了可推广的研究范式。
创新点
首次通过计算和实验结合，确定了NFSS催化sesterfisherol生物合成按Path a进行；揭示F191通过C-H-π相互作用加速1,2-H迁移并保护碳正离子中间体；F191A突变体产生两种新型sesterterpenes。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21-Gold(DE3) | — | — | — | 能量供给 | 用于异源表达NFSS及突变体，提供代谢环境 |
| — | sesterterpene生物合成 | NfSS | NFSS | 催化 | 真菌萜类合酶，催化GFPP环化生成sesterfisherol |
| — | — | NfSS(F191A) | NFSS F191A突变体 | 催化 | 失去产生sesterfisherol的能力，产生化合物2和3 |
关键发现
- DFT计算表明Path a和Path b均能量可行，但实验证实NFSS催化经Path a进行
- 关键氨基酸F191突变体F191A不再产生sesterfisherol，而生成新化合物2（0.18 mg/L）和3（0.04 mg/L）
- Path a中D环形成的活化能为13.3 kcal/mol，Path b中B环形成活化能12.4 kcal/mol
- TS_8a-9a活化能为0.7 kcal/mol（M06-2X）或-0.2 kcal/mol（mPW1PW91）
- 三喹烷形成稳定化能为-32.4 kcal/mol
- IM9a到IM10a的活化能为24.7 kcal/mol
- C-H-π相互作用可显著降低1,2-H迁移的活化能垒。
研究结论
本研究结合DFT计算与定点突变实验，证明sesterfisherol的生物合成由NFSS经Path a（A-D-B/C环化顺序）催化完成；F191残基通过C-H-π相互作用在加速氢迁移和保护碳正离子中起关键作用，为其他萜类合酶的环化机制提供了新见解。