Increased flux in acetyl-CoA synthetic pathway and TCA cycle of Kluyveromyces marxianus under respiratory conditions
- 作者
- Yuri Sakihama, Ryota Hidese, Tomohisa Hasunuma, Akihiko Kondo
- 杂志
- Scientific Reports（2019）
- DOI
- 10.1038/s41598-019-41863-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
揭示Crabtree阴性酵母Kluyveromyces marxianus在有氧条件下抑制乙醇生产并增强乙酰辅酶A合成及TCA循环通量的代谢机制，并与Crabtree阳性酵母Saccharomyces cerevisiae进行比较。
研究策略
通过qPCR转录分析、LC-QqQ-MS代谢物池大小分析、13C标记代谢转换分析及酶活测定，比较两种酵母在好氧和厌氧条件下的中心碳代谢差异。
研究路线图
核心内容
该研究以Crabtree阴性酵母Kluyveromyces marxianus为对象，通过qPCR转录分析、LC-QqQ-MS代谢物池测定、13C标记代谢转换分析和酶活测定，系统比较了其与Crabtree阳性酵母Saccharomyces cerevisiae在好氧和厌氧条件下的中心碳代谢差异。结果显示，K. marxianus好氧培养时乙醇峰值仅0.5 g/L（厌氧高达22.1 g/L），乙酸低于0.5 g/L，细胞密度OD600达121；好氧条件下丙酮酸池比厌氧低4.5倍，苹果酸和异柠檬酸等TCA中间物池明显降低，苹果酸13C标记约30%（厌氧10%）。转录分析发现CIT3、ICL1、MAE1和ACS1分别上调9.99、11.91、5.40和4.19倍（log2），而HXK2、CDC19和HXT3分别下调3.48、4.18和4.22倍；酶活方面MAE提高2倍，HXK降低0.8倍。相比之下，S. cerevisiae好氧时乙醇仍达22.1 g/L。该研究首次阐明K. marxianus在呼吸条件下通过上调乙醇同化和丙酮酸脱氢酶基因、增强氧化性和还原性TCA循环通量，同时降低己糖激酶活性和葡萄糖摄取，有效抑制乙醇和乙酸生成，为酵母代谢工程改造提供了新靶点和理论基础。
创新点
首次阐明K. marxianus在呼吸条件下通过上调乙醇同化及丙酮酸脱氢酶基因、增强氧化性TCA循环和还原性TCA循环来支持高效电子流，同时降低己糖激酶活性以维持适当的碳通量。
研究对象（38）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 全局 | — | — | — | Crabtree阳性酵母对照，好氧条件下仍高产乙醇（22.1 g/L） |
| Kluyveromyces marxianus | 全局 | — | — | — | Crabtree阴性酵母，好氧条件下乙醇和乙酸产量极低（0.5和<0.5 g/L） |
| Kluyveromyces marxianus | 糖酵解/葡萄糖摄取 | HXT3 | Hexose transporter | 转运 | 好氧/厌氧 log2 FC: -4.22 |
| Kluyveromyces marxianus | 糖酵解 | HXK2 | Hexokinase II | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: -3.48，酶活性好氧为厌氧的0.8倍 |
| Kluyveromyces marxianus | 糖酵解 | PGI1 | Glucose-6-phosphate isomerase | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: -1.31 |
| Kluyveromyces marxianus | 糖酵解 | PFK1 | Phosphofructokinase alpha subunit | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: -1.77 |
| Kluyveromyces marxianus | 糖异生/糖酵解 | FBP1 | Fructose-1,6-bisphosphatase | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: 1.83 |
| Kluyveromyces marxianus | 糖酵解 | FBA1 | Aldolase | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: -2.59 |
| Kluyveromyces marxianus | 糖酵解 | TDH1 | Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1 | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: 3.86 |
| Kluyveromyces marxianus | 糖酵解 | TDH3 | Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3 | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: -1.73 |
| Kluyveromyces marxianus | 糖酵解 | PGK1 | 3-Phosphoglycerate kinase | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: -2.08 |
| Kluyveromyces marxianus | 糖酵解 | ENO1 | Enolase 1 | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: -2.18 |
| Kluyveromyces marxianus | 糖酵解 | CDC19 | Pyruvate kinase 1 | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: -4.18 |
| Kluyveromyces marxianus | 乙酰CoA合成 | PDA1 | Pyruvate dehydrogenase complex component E1 alpha | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: 1.92 |
| Kluyveromyces marxianus | 乙酰CoA合成 | LAT1 | Pyruvate dehydrogenase complex component E2 | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: 1.72 |
| Kluyveromyces marxianus | 乙醇代谢 | PDC1 | Pyruvate decarboxylase isozyme 1 | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: -2.28 |
| Kluyveromyces marxianus | 乙醇代谢 | ADH1 | Alcohol dehydrogenase I, cytoplasmic | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: -0.01 |
| Kluyveromyces marxianus | 乙醇代谢 | ADH2 | Alcohol dehydrogenase II, cytoplasmic | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: 2.23 |
| Kluyveromyces marxianus | 乙醇代谢 | ADH3 | Alcohol dehydrogenase III, mitochondrial | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: 2.63 |
| Kluyveromyces marxianus | 乙醇代谢 | ADH4 | Alcohol dehydrogenase IV, cytoplasmic | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: 1.68 |
| Kluyveromyces marxianus | 乙醇代谢 | ALD2 | Aldehyde dehydrogenase | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: 1.07 |
| Kluyveromyces marxianus | 乙酰CoA合成 | ACS1 | Acetyl-coenzyme A synthetase 1 | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: 4.19 |
| Kluyveromyces marxianus | 乙酰CoA合成 | ACS2 | Acetyl-coenzyme A synthetase 2 | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: 0.95 |
| Kluyveromyces marxianus | TCA循环 | CIT3 | Citrate synthase 3, mitochondrial | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: 9.99 |
| Kluyveromyces marxianus | TCA循环 | ACO1 | Aconitase, cytoplasmic | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: 2.59 |
| Kluyveromyces marxianus | TCA循环 | IDH1 | Isocitrate dehydrogenase, cytoplasmic | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: 3.69 |
| Kluyveromyces marxianus | TCA循环 | KGD1 | 2-Oxoglutarate dehydrogenase, mitochondrial | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: 3.64 |
| Kluyveromyces marxianus | TCA循环 | LSC2 | Succinate-CoA ligase [ADP-forming] subunit beta, mitochondrial | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: 2.21 |
| Kluyveromyces marxianus | TCA循环 | SDH2 | Succinate dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur subunit, mitochondrial | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: 1.85 |
| Kluyveromyces marxianus | TCA循环 | FUM1 | Fumarate hydratase, mitochondrial | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: 1.73 |
| Kluyveromyces marxianus | TCA循环 | MDH1 | Malate dehydrogenase, mitochondrial | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: 1.74 |
| Kluyveromyces marxianus | TCA循环 | MDH2 | Malate dehydrogenase, cytoplasmic | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: -0.63 |
| Kluyveromyces marxianus | TCA循环 | MDH3 | Malate dehydrogenase, peroxisomal | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: 1.92 |
| Kluyveromyces marxianus | TCA循环/乙醛酸循环 | ICL1 | Isocitrate lyase | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: 11.91 |
| Kluyveromyces marxianus | TCA循环/乙醛酸循环 | MLS1 | Malate synthase 1, glyoxysomal | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: 5.20 |
| Kluyveromyces marxianus | 回补途径 | PCK1 | Phosphoenolpyruvate carboxykinase (ATP) | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: -0.89 |
| Kluyveromyces marxianus | 回补途径 | PYC2 | Pyruvate carboxylase 2 | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: -0.19 |
| Kluyveromyces marxianus | 回补途径 | MAE1 | NAD-dependent malic enzyme, mitochondrial | 催化 | 好氧/厌氧 log2 FC: 5.40，酶活性好氧为厌氧的2.0倍 |
关键发现
- K. marxianus好氧培养乙醇峰值仅0.5 g/L（厌氧22.1 g/L），乙酸<0.5 g/L（厌氧7.0 g/L），细胞密度OD600达121（厌氧42）
- 好氧条件下丙酮酸池比厌氧低4.5倍，而苹果酸、异柠檬酸等TCA中间物池明显降低
- MAE活性提高2倍，MDH活性显著增强，HXK活性降低0.8倍
- 转录组显示CIT3上调9.99倍（log2）、ICL1上调11.91倍、MAE1上调5.40倍、ACS1上调4.19倍，而HXK2下调3.48倍、CDC19下调4.18倍、HXT3下调4.22倍
- 13C标记显示好氧下苹果酸13C分数约30%（厌氧10%），2-酮戊二酸约10%（厌氧<1%）。相比之下，S. cerevisiae好氧乙醇仍达22.1 g/L，苹果酸13C分数好氧60%、厌氧40%。
研究结论
K. marxianus在呼吸条件下通过增强乙酰CoA合成和TCA循环通量（包括氧化性和还原性分支）、同时降低葡萄糖摄取速率，有效抑制乙醇和乙酸生成，该机制为酵母代谢工程改造提供了新靶点和理论基础。