Rerouting of NADPH synthetic pathways for increased protopanaxadiol production in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Jae-Eung Kim, In-Seung Jang, Bong Hyun Sung, Sun Chang Kim, Ju Young Lee
- 杂志
- Scientific Reports（2018）
- DOI
- 10.1038/s41598-018-34210-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在酿酒酵母中构建原人参二醇（PPD）生物合成途径时产量极低，主要受限于关键酶表达不平衡以及胞内 NADPH 辅因子供应不足，需要系统改造代谢网络以提高 PPD 产量。
研究策略
通过不同启动子（PGPD、PCCW12、PADH2）组合优化 PgDS 和 PgPPDS 的表达平衡；通过替换或删除辅因子代谢相关基因（如 ALD2→ALD6、GDH1→GDH2、删除 ZWF1、过表达 ZMS1 等）重路由 NADPH 合成途径，提高胞内 NADPH 可用性，从而增强 PPD 合成。
核心内容
该研究以酿酒酵母CEN.PK2-1D为底盘，系统改造代谢网络以提高原人参二醇（PPD）产量。作者首先通过不同启动子组合优化达玛烯二醇-II合酶与PPD合酶的表达平衡，并利用乙醇依赖型启动子PADH2实现细胞生长与产物合成的阶段分离，使产量从初始菌株的0.54 mg/L提升至1.34 mg/L。随后围绕NADPH供给进行辅因子工程：用NADP+依赖的乙醛脱氢酶ALD6替换NAD+依赖的ALD2，并以NAD+依赖的谷氨酸脱氢酶GDH2替换NADP+依赖的GDH1，同时评估ZWF1、STB5、ZMS1等基因的过表达或删除效应。最终工程菌株PPD08在144 h产量达6.01 mg/L，较初始菌株提高11倍以上。NADPH测定显示，ALD6替换和GDH2替换分别使NADPH水平提高1.3倍和1.5倍，且NADPH/NADP+比值与PPD产量呈正相关。该工作证明提升NADPH可用性是增强酵母中萜类化合物合成的有效策略，但氧化还原平衡改造伴随生长受损，后续需结合发酵优化加以弥补。
创新点
['首次证明提升 NADPH 可用性可显著提高酿酒酵母中 PPD 产量', '利用葡萄糖/乙醇依赖型启动子（PADH2）实现细胞生长与 PPD 生产的阶段分离', '通过 ALD6 替换 ALD2 将乙醛脱氢酶的辅因子偏好从 NAD+ 转变为 NADP+，有效增加 NADPH 供给', '系统评估了多个 NADPH 相关基因（ZWF1、GND1、STB5、GDH1/GDH2、ALD2/ALD6、ZMS1）对 PPD 生产的影响']
研究对象（16）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D | 甲羟戊酸（MVA）途径 | tHMG1 | 截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 去除膜结合区过表达，增加角鲨烯前体供应 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D | MVA/异戊二烯途径 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶（FPS） | 催化 | 过表达以增强FPP前体供给 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D | 三萜/人参皂苷生物合成途径 | PgDS | 达玛烯二醇-II合酶 | 催化 | 来自人参，催化2,3-氧化角鲨烯环化生成达玛烯二醇-II |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D | 三萜/人参皂苷生物合成途径 | PgPPDS | 原人参二醇合酶（CYP716A47） | 催化 | 来自人参，催化达玛烯二醇-II羟基化生成PPD，依赖NADPH |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D | 三萜/人参皂苷生物合成途径 | AtCPR1 | NADPH-细胞色素P450还原酶 | 催化 | 来自拟南芥，为PgPPDS提供电子 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D | 乙酸/乙醛代谢途径 | ALD2 | 乙醛脱氢酶（NAD+依赖） | 催化 | 删除或替换为ALD6以改变辅因子偏好 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D | 乙酸/乙醛代谢途径 | ALD6 | 乙醛脱氢酶（NADP+依赖） | 催化 | 替换ALD2以增加NADPH生成 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D | 铵同化/谷氨酸代谢途径 | GDH1 | NADP+依赖的谷氨酸脱氢酶 | 催化 | 删除以减少NADPH消耗 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D | 铵同化/谷氨酸代谢途径 | GDH2 | NAD+依赖的谷氨酸脱氢酶 | 催化 | 过表达以补偿GDH1缺失，减少NADPH消耗 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D | 磷酸戊糖（PP）途径 | ZWF1 | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 | 催化 | 过表达可增加NADPH，但在PPD08中删除以重定向碳流 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D | 磷酸戊糖（PP）途径 | GND1 | 6-磷酸葡糖酸脱氢酶 | 催化 | 过表达但未显著提高NADPH水平 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D | 磷酸戊糖（PP）途径 | STB5 | 锌簇转录因子Stb5p | 调控 | 过表达可上调PP途径基因，增加NADPH |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D | 乙酸/乙醛代谢途径 | ZMS1 | 锌簇蛋白Zms1p（转录因子） | 调控 | 过表达上调ALD6，增加NADPH生成 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D | FPP分支/法尼醇代谢 | LPP1 | 脂质磷酸磷酸酶 | 催化 | 删除以阻断法尼醇合成，减少碳流分支 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D | FPP分支/法尼醇代谢 | DPP1 | 二酰基甘油焦磷酸磷酸酶 | 催化 | 删除以阻断法尼醇合成，减少碳流分支 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D | 辅因子代谢 | POS5 | NADH激酶 | 催化 | 过表达尝试增加NADPH，但导致生长抑制，未获得有效产量 |
关键发现
- 初始菌株 PPD01 在 144 h 仅产 PPD
- 54 mg/L；使用 PADH2 同时表达 PgDS 和 PgPPDS 的 PPD05 菌株产量提高到
- 34 mg/L（为 PPD01 的
- 5 倍）；在 PPD05 基础上用 ALD6 替换 ALD2 构建的 PPD08 菌株在 144 h 产量达
- 01 mg/L，较初始菌株提高 11 倍以上。NADPH 浓度测定显示，过表达 ZWF1 或 STB5 分别使 NADPH 提高
- 4 倍和
- 2 倍；-ALD2+ALD6 和 -GDH1+GDH2 组合分别使 NADPH 提高
- 3 倍和
- 5 倍。PPD08 中 NADPH/NADP+ 比值与 PPD 产量呈正相关；删除 ZWF1 的 PPD12 与 PPD08 产量相似（5.66 mg/L vs
- 01 mg/L），但总 NADPH+NADP+ 浓度在 120 h 较 PPD08 下降约 50%。过表达 ZMS1 的 PPD10 在 144 h 产量为
- 35 mg/L，为 PPD05 的
- 5 倍，但仍低于 PPD08。
研究结论
通过优化启动子组合和重路由 NADPH 合成途径，在酿酒酵母中实现了 PPD 产量较初始菌株 11 倍以上的提升（6.01 mg/L vs 0.54 mg/L），证明增加 NADPH 可用性是提高 PPD 产量的有效策略，该策略可推广至其他工业相关萜类化合物的微生物生产。但氧化还原平衡改造会损害细胞生长，未来需结合发酵优化等手段恢复生长缺陷并进一步提升产量。