Proteomic analysis reveals novel insights into tanshinones biosynthesis in Salvia miltiorrhiza hairy roots
- 作者
- Angela Contreras, Baptiste Leroy, Pierre-Antoine Mariage, Ruddy Wattiez
- 杂志
- Scientific Reports（2019）
- DOI
- 10.1038/s41598-019-42164-3
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
丹参毛状根中丹参酮生物合成的分子机制尚不清楚，尤其在蛋白质水平上缺乏系统研究，导致其生物合成途径尚未完全解析。
研究策略
利用酵母提取物（YE）和硝酸银（Ag+）联合诱导丹参毛状根积累丹参酮，采用无标记定量蛋白质组学（LC-MS/MS）比较低（6 mg/g DW）和高（22 mg/g DW）丹参酮浓度样本的差异蛋白表达谱，并结合构建的丹参蛋白质数据库筛选候选催化酶。
研究路线图
核心内容
本研究通过无标记定量蛋白质组学手段，对丹参毛状根中丹参酮生物合成的分子机制进行了系统探究。研究人员利用酵母提取物和硝酸银联合诱导丹参毛状根积累丹参酮，比较低、高两种丹参酮浓度样本的差异蛋白表达谱，并整合基因组、转录组及NCBI序列构建了包含52092条非冗余序列的丹参蛋白质数据库，用以筛选候选催化酶。联合诱导处理5周后，总丹参酮含量达到22 mg/g DW，为对照的15倍，其中隐丹参酮达8.39 mg/g DW（419倍对照），二氢丹参酮I达2.64 mg/g DW（264倍对照）。共鉴定出2650个蛋白质，893个表达显著变化，251个上调、642个下调，上调蛋白中代谢类占47%。关键酶GGPPS和CMK分别上调20倍和18倍，显示MEP途径被强烈激活。研究还筛选出5个新的细胞色素P450和5个BBE-like酶作为候选蛋白，其中i14488_g1_i1上调29.5倍。这些结果揭示了MEP途径、特定CYP450以及新发现的候选酶与丹参酮积累密切相关，为丹参酮合成途径的完整解析和代谢工程改良提供了重要基础。
创新点
构建了包含52092条非冗余序列的丹参蛋白质数据库（整合基因组、转录组和NCBI序列）；首次通过蛋白质组学筛选出5个新细胞色素P450和5个FAD-binding berberine（BBE-like）酶作为丹参酮生物合成候选蛋白；诱导获得迄今报道的最高丹参酮产量22 mg/g DW。
研究对象（24）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | MVA（甲羟戊酸）途径 | AACT | 乙酰辅酶A C-乙酰转移酶 | 催化 | E5样本中丰度略高于对照 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | MVA（甲羟戊酸）途径 | HMGR | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | MVA途径限速酶 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | MVA（甲羟戊酸）途径 | PMK | 5-磷酸甲羟戊酸激酶 | 催化 | E2样本中上调 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | MEP（甲基赤藓醇磷酸）途径 | DXS | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | E2中显著上调 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | MEP（甲基赤藓醇磷酸）途径 | DXR | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 | 催化 | E2/E5相似上调 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | MEP（甲基赤藓醇磷酸）途径 | CMK | 4-(胞苷5'-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶 | 催化 | E5中表达为对照18倍 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | MEP（甲基赤藓醇磷酸）途径 | MCT | 2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶 | 催化 | E2中显著上调 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | MEP（甲基赤藓醇磷酸）途径 | MDS | 2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶 | 催化 | E2中显著上调 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | MEP（甲基赤藓醇磷酸）途径 | HDS | 4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸合酶 | 催化 | E5中高丰度 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 萜类前体生物合成 | GGPPS | 香叶基香叶基二磷酸合酶 | 催化 | E5中上调20倍 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成 | CPS | 柯巴基二磷酸合酶 | 催化 | 催化GGPP转化为miltiraidene |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成 | KSL | 类贝壳杉烯合酶 | 催化 | — |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成 | CYP76AH1 | 铁锈醇合酶 | 催化 | 催化miltiraidene转化为铁锈醇 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成 | CYP76AH3 | 细胞色素P450 76AH3 | 催化 | — |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成 | CYP76AK1 | 细胞色素P450 76AK1 | 催化 | RNAi抑制降低丹参酮IIA、隐丹参酮和丹参酮I |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成（推测） | — | K19819_g1_i5（CYP71D411-like） | 催化 | E5上调7.5倍，与CYP71D411有65%同一性 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成（推测） | — | CL2946Contig1（CYP71D411-like） | 催化 | E5上调5.4倍，与AGN04216.1有99%同一性 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成（推测） | — | CL253Contig9（CYP72A329-like） | 催化 | 与CYP72A329有90%同一性，E2/E5均上调 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成（推测） | — | CL2951Contig1（CYP71D329-like） | 催化 | 仅E5显著上调，与CYP71D329有77%同一性 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成（推测） | — | CL45324Contig1（CYP450还原酶2） | 催化 | 功能未知，推测参与下游还原步骤 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成（推测） | — | evm.model.scaffold10983.1（2OGD-like） | 催化 | 与2OGD5有60%同一性，E5中8.0倍上调 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成（推测） | — | k15043_g1_i1（2OGD-like） | 催化 | 与2OGD5有66%同一性，E2/E5均上调约8倍 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成（推测） | — | i14488_g1_i1（BBE-like） | 催化 | E5中上调29.5倍 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成（推测） | — | k17860_g1_i1（BBE-like） | 催化 | E5中上调18.3倍 |
关键发现
- 酵母提取物（1 g/L）和硝酸银（0.41 mM）联合诱导5周后总丹参酮含量达22 mg/g DW，为对照的15倍
- 诱导2周为6 mg/g DW。其中二氢丹参酮I达2.64 mg/g DW（264倍对照）、隐丹参酮8.39 mg/g DW（419倍对照）、四氢丹参酮I 8.69 mg/g DW（6倍对照）。共鉴定2650个蛋白质，其中893个表达显著变化（p<0.05，251个上调、642个下调）
- 上调蛋白中代谢类占47%、胁迫防御18%、氧化还原10%。GGPPS在E5中上调20倍，CMK上调18倍。筛选出5个新CYP450（如K19819_g1_i5上调7.5倍、CL2946Contig1上调5.4倍）和5个BBE-like酶（如i14488_g1_i1上调29.5倍、k17860_g1_i1上调18.3倍）作为候选蛋白。
研究结论
本研究通过无标记定量蛋白质组学揭示了MEP途径、特定细胞色素P450（CYP76AH1/AH3/AK1）以及新发现的CYP450和BBE-like酶与丹参酮积累密切相关，为丹参酮生物合成途径的完整解析和通过代谢工程提高产量提供了重要基础。