Overcoming NADPH product inhibition improves D-sorbitol conversion to L-sorbose
- 作者
- Tae-Su Kim, Hui Gao, Jinglin Li, Vipin C. Kalia, Karthikeyan Muthusamy, Jae Kyung Song, In-Won Kim, Jung-Ku Lee
- 杂志
- Scientific Reports（2019）
- DOI
- 10.1038/s41598-018-37401-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
GoSLDH催化D-山梨醇氧化为L-山梨糖时，NADPH产物抑制酶活性（Ki=100 μM），导致转化率低、辅因子消耗大。
研究策略
在E. coli和G. oxydans中共表达D-山梨醇脱氢酶（GoSLDH）与来自罗伊氏乳杆菌的NADPH氧化酶（LreNOX），通过LreNOX将NADPH再生为NADP+，从而解除产物抑制并实现辅因子循环。
研究路线图
核心内容
该研究针对NADPH产物抑制导致D-山梨醇向L-山梨糖转化效率低的问题，提出通过共表达NADPH氧化酶再生NADP+的策略。研究首先发现NADPH对Glucose oxidase来源的D-山梨醇脱氢酶（GoSLDH）存在竞争性产物抑制，抑制常数Ki为100 μM，且当NADPH浓度在70–150 μM时，酶对NADP+的Km增加3.9至8.9倍。为解除该抑制，作者在E. coli和G. oxydans中分别共表达GoSLDH与来源于罗伊氏乳杆菌的水形成型NADPH氧化酶LreNOX，后者可将NADPH氧化为NADP+，实现辅因子循环。在E. coli中，共表达菌株在0.5 mM NADP+下于40分钟内积累4.1 g/L L-山梨糖，转化率达92%，较仅表达GoSLDH的菌株产量提高20.5倍，同时胞内NADPH积累量从147 μM降至32.2 μM。在G. oxydans中，重组菌转化率达96.6%，比野生型高2.9倍，L-山梨糖生产率达12.1 g/L/h，接近目前报道的最高水平。该研究证明LreNOX介导的NADP+再生可有效解除产物抑制，大幅提升NADP+依赖性生物转化的效率并降低辅因子需求，为稀有糖的工业化生产提供了一种经济可行的代谢工程策略。
创新点
['首次报道NADPH对GoSLDH的竞争性产物抑制（Ki=100 μM）', '利用LreNOX（对NADPH高活性的水形成型NADH氧化酶）构建NADP+再生系统', '在E. coli和G. oxydans中实现共表达，显著提高L-山梨糖产量和转化率']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21-Codon Plus (DE3)-RIL | D-山梨醇氧化为L-山梨糖 | gosldh | GoSLDH | 催化 | 来自Gluconobacter oxydans G624的山梨醇脱氢酶，催化D-山梨醇氧化为L-山梨糖，以NADP+为辅因子 |
| Escherichia coli BL21-Codon Plus (DE3)-RIL | NADPH氧化为NADP+ | lrenox | LreNOX | 催化 | 来自Lactobacillus reuteri的NADPH氧化酶，催化NADPH氧化生成NADP+（水形成型），用于辅因子再生 |
| Gluconobacter oxydans KCTC 1091 | D-山梨醇氧化为L-山梨糖 | gosldh | GoSLDH | 催化 | 在G. oxydans中异源表达，提高L-山梨糖产量 |
| Gluconobacter oxydans KCTC 1091 | NADPH氧化为NADP+ | lrenox | LreNOX | 催化 | 在G. oxydans中共表达，促进NADP+再生，解除NADPH抑制 |
关键发现
- GoSLDH纯酶的催化活性为3570 U/mg
- NADPH对GoSLDH的Ki为100 μM
- NADPH浓度70-150 μM时Km增加3.9-8.9倍
- E. coli gosldh-lrenox在0.5 mM NADP+下转化率达92%，L-山梨糖产量4.1 g/L（40 min），较E. coli gosldh提高20.5倍
- NADPH积累量从147 μM降至32.2 μM
- D-山梨醇转化率提高23倍（文中提到23-fold higher conversion rate，但注意原文有笔误：E. coli gosldh-lrenox exhibited 23-fold higher conversion rate than E. coli gosldh-lrenox，应为比E. coli gosldh高，根据上下文取23倍）
- 在G. oxydans中，重组菌G. oxydans gosldh-lrenox转化率达96.6%，比野生型高2.9倍，L-山梨糖生产率12.1 g/L/h，接近最高报道值13.6 g/L/h。
研究结论
利用LreNOX再生NADP+可有效解除NADPH产物抑制，提高NADP+依赖性酶促反应中L-山梨糖的生产效率，并降低辅因子用量，为稀有糖生产提供了经济高效的生物催化策略。