The enzymes OSC1 and CYP716A263 produce a high variety of triterpenoids in the latex of Taraxacum koksaghyz
- 作者
- Katharina M. Putter, Nicole van Deenen, Boje Müller, Lea Fuchs, Kirsten Vorwerk, Kristina Unland, Jan Niklas Bröker, Emely Scherer, Claudia Huber, Wolfgang Eisenreich, Dirk Prüfer, Christian Schulze Gronover
- 杂志
- Scientific Reports（2019）
- DOI
- 10.1038/s41598-019-42381-w
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析橡胶草（Taraxacum koksaghyz）胶乳天然橡胶中的五环三萜组成，并克隆与功能鉴定参与三萜合成及C-3氧化的关键酶（OSC和CYP716A263）。
研究策略
用丙酮提取天然橡胶中的脂质，结合两步HPLC、GC-MS和NMR鉴定三萜；基于转录组和基因组挖掘OSC与P450基因，在本氏烟草和酿酒酵母中异源表达，并通过共表达HMGR增强前体供给来验证酶功能。
核心内容
该研究以橡胶草胶乳为对象，系统解析了其中天然橡胶所含五环三萜的组成，并克隆鉴定了参与三萜合成及修饰的关键酶。通过丙酮提取胶乳脂质，结合两步HPLC、GC-MS和NMR技术，鉴定出13种已知三萜及多种酮类衍生物，其中taraxasterol含量最高（45.2%），β-amyrin占12.6%，并首次发现了新化合物lup-19(21)-en-3-ol及其酮衍生物；两步HPLC纯化可将单个三萜纯度提升至96–100%。基于转录组挖掘，在烟草和酵母中异源表达了多功能氧化鲨烯环化酶TkOSC1，证实其至少可合成7种三萜，包括taraxasterol、α-/β-amyrin和lup-19(21)-en-3-ol；同时表征了首个来自蒲公英胶乳的P450酶CYP716A263，该酶可将taraxasterol、lupeol和β-amyrin氧化为相应的C-3酮。共表达HMGR增强前体供给进一步验证了酶功能。这些结果明确了TkOSC1和CYP716A263是橡胶草胶乳五环三萜多样性的关键决定因子，为利用异源体系生产高价值三萜化合物以及通过代谢工程调控天然橡胶性质提供了重要酶学工具。
创新点
1. 首次从橡胶草胶乳中鉴定新五环三萜lup-19(21)-en-3-ol及其酮衍生物；2. 建立两步HPLC纯化单个三萜的方法，纯度达96-100%；3. 首次功能表征多功能OSC TKOSC1（至少合成7种三萜）和CYP716A263的C-3位氧化活性（首个作用于蒲公英胶乳的P450）。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana | 三萜生物合成 | TkOSC1 | TKOSC1 | 催化 | 多功能氧化角鲨烯环化酶，异源表达可合成taraxasterol、α-和β-amyrin等 |
| Saccharomyces cerevisiae | 三萜生物合成 | TkOSC1 | TKOSC1 | 催化 | 在酵母中至少产生7种三萜，包括lup-19(21)-en-3-ol |
| Nicotiana benthamiana | 三萜生物合成 | CYP716A263 | CYP716A263 | 催化 | P450酶，催化C-3位氧化，将taraxasterol等转化为酮 |
| Saccharomyces cerevisiae | 三萜生物合成 | CYP716A263 | CYP716A263 | 催化 | 与AtR2共表达，催化taraxasterol氧化为taraxasterone |
| Nicotiana benthamiana | 三萜生物合成 | TkLUP | TKLUP | 催化 | 羽扇醇合酶，主要合成lupeol，少量β-amyrin |
| Nicotiana benthamiana | 三萜生物合成 | TkOSC6 | TKOSC6 | 催化 | β-amyrin合酶，主要产生β-amyrin |
| Saccharomyces cerevisiae | 三萜生物合成 | TkOSC6 | TKOSC6 | 催化 | 在酵母中主要产生β-amyrin |
| Nicotiana benthamiana | 甲羟戊酸途径 | Tkhmgrc1 | TkHMGR1（催化域） | 催化 | 截短型3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，增加前体供给 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | AtR2 | ATR2 | 催化 | NADPH-细胞色素P450还原酶，为CYP716A263提供电子 |
关键发现
- 丙酮提取物中鉴定出13种三萜/三萜类化合物（含未知共18种），其中taraxasterol占45.2%，β-amyrin
- 6%，lup-19(21)-en-3-ol
- 2%，α-amyrin
- 8%，lupeol
- 1%，taraxerol
- 08%，酮类衍生物共14.2%，甾醇0.9%，未知三萜15.9%。两步HPLC纯化纯度最高100%。TkOSC1在酵母中至少合成7种三萜，包括taraxasterol、α-/β-amyrin和lup-19(21)-en-3-ol；CYP716A263可将taraxasterol、lupeol和β-amyrin氧化为相应的C-3酮。
研究结论
TkOSC1和CYP716A263是橡胶草胶乳中五环三萜多样性的关键酶，CYP716A263催化C-3氧化生成酮类三萜，为异源生产五环三萜及调控天然橡胶性质提供了工具。