Restoring the Taxol biosynthesis machinery of Aspergillus terreus by Podocarpus gracilior Pilger microbiome, with retrieving the ribosome biogenesis proteins of WD40 superfamily
- 作者
- Ashraf S. A. El-Sayed, Nabil Z. Mohamed, Samia afan, Marwa A. Yassin, Lamis Shaban, Ahmed A. Shindia, Gul Shad Ali, Mahmoud Z. Sitohy
- 杂志
- Scientific Reports（2019）
- DOI
- 10.1038/s41598-019-47816-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解决 Aspergillus terreus 在连续传代和储存过程中紫杉醇产量衰减的问题，并探究通过 Podocarpus gracilior 叶片恢复其紫杉醇生物合成机制。
研究策略
通过连续传代和储存实验评估紫杉醇产量衰减，测定限速酶活性、基因表达、乙酰辅酶A水平及蛋白质组变化，并利用表面灭菌的 P. gracilior 叶片共培养恢复紫杉醇合成能力，结合蛋白鉴定分析关键蛋白。
研究路线图
核心内容
该研究针对土曲霉在连续传代和储存中紫杉醇产量显著衰减的问题，考察了Podocarpus gracilior叶片微生物组对其生物合成机制的恢复作用。作者通过传代实验测定产量、限速酶活性、基因表达及乙酰辅酶A水平，并结合蛋白质组分析，发现产量衰减与乙酰辅酶A通量下降及核糖体生物发生蛋白YTM（WD40超家族）表达下调密切相关。原始培养紫杉醇产量为268 μg/L，第10次传代降至78.2 μg/L，限速酶活性保留不足初始的10%，tds、dbat、bapt基因表达降低约15至35倍。将表面灭菌的P. gracilior叶片以3%比例加入第7代培养后，产量从124 μg/L升至395 μg/L，基因表达恢复4至5倍，乙酰辅酶A浓度提高2.8至5.4倍并恢复至原始水平以上。蛋白质组鉴定出74.4 kDa的YTM蛋白，其表达与产量呈正相关。结果表明，该叶片微生物组可通过恢复核糖体生物发生蛋白表达和乙酰辅酶A供应，重启紫杉醇合成，为构建代谢稳定的工业菌株提供了新靶点。
创新点
首次将紫杉醇生物合成能力衰减与乙酰辅酶A通量及核糖体生物发生蛋白（WD40超家族）联系起来，并发现 P. gracilior 叶片的微生物组可通过恢复这些蛋白表达而重启紫杉醇合成。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aspergillus terreus EFB108 | 紫杉醇生物合成 | ggpps | GGPPS (geranylgeranyl pyrophosphate synthase) | 催化 | 限速酶，催化GGPP合成 |
| Aspergillus terreus EFB108 | 紫杉醇生物合成 | tds | TDS (taxadiene synthase) | 催化 | 紫杉二烯合酶，催化GGPP环化 |
| Aspergillus terreus EFB108 | 紫杉醇生物合成 | dbat | DBAT (10-deacetylbaccatin III-10-O-acetyltransferase) | 催化 | 10-脱乙酰巴卡亭III乙酰转移酶 |
| Aspergillus terreus EFB108 | 紫杉醇生物合成 | bapt | BAPT (baccatin III 13-O-(3-amino-3-phenylpropanoyl)transferase) | 催化 | 巴卡亭III 13-O-苯丙酰转移酶 |
| Aspergillus terreus EFB108 | 紫杉醇生物合成 | — | ribosome biogenesis protein YTM (WD40 superfamily) | 调控 | 属于WD40蛋白超家族，参与核糖体生物发生，可能间接调控紫杉醇合成 |
关键发现
- 原始培养 A. terreus 紫杉醇产量为 268 μg/L，第10次传代降至 78.2 μg/L（降低约4倍）
- 第5、7代产量分别为133.4和94.7 μg/L
- 第6代后丧失约60%产能。添加3% P. gracilior 灭菌叶片后，第7代培养的紫杉醇产量从124 μg/L升至395 μg/L（提高约3.2倍），0.5%和1%叶片分别使产量增至210和315 μg/L。限速酶GGPPS、TDS、DBAT、BAPT活性随传代降低，第10代保留不足10%初始活性
- qPCR显示tds、dbat、bapt基因表达在第5和第10代分别降低约15倍和35倍。添加3%叶片后这些基因表达恢复4-5倍。细胞内乙酰-CoA浓度从原始培养的870.1 ppm降至第3、5、7代的620.2、515、450.9 ppm，添加3%叶片后恢复至原始水平以上（提高2.8-5.4倍）。蛋白质组分析鉴定出74.4 kDa蛋白为核糖体生物发生蛋白YTM（WD40超家族），其表达与紫杉醇产量正相关。
研究结论
A. terreus 紫杉醇产量衰减源于乙酰辅酶A流向减少和核糖体生物发生蛋白YTM（WD40超家族）表达下调；添加 P. gracilior 叶片可通过微生物组信号恢复这些蛋白表达和乙酰辅酶A水平，从而完全恢复紫杉醇生物合成能力，为构建代谢稳定的紫杉醇工业菌株提供了新靶点。