Characterization of CYP71AX36 from Sunflower (Helianthus annuus L., Asteraceae)
- 作者
- Maximilian Frey, Iris Klaiber, Jürgen Conrad, Aylin Bersch, Irini Pateraki, Dae-Kyun Ro, Otmar Spring
- 杂志
- Scientific Reports（2019）
- DOI
- 10.1038/s41598-019-50520-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定并表征向日葵中催化costunolide C14位羟基化的细胞色素P450酶CYP71AX36，为倍半萜内酯的结构修饰提供新的酶工具。
研究策略
利用酿酒酵母和本氏烟草异源表达系统进行体内途径重建，共表达底物合成基因（如GAS、GAO、LsCOS）与候选P450基因，通过LC-MS和NMR鉴定酶产物，并利用系统发育和基因组定位分析酶的进化与组织分布。
研究路线图
核心内容
本研究从向日葵中克隆并表征了一个新的细胞色素P450酶CYP71AX36，鉴定其催化倍半萜内酯costunolide的C14位特异性羟基化。研究者在酿酒酵母和本氏烟草中重建了底物合成途径，通过共表达costunolide合成基因（HaGAS1、HaGAO、LsCOS等）与CYP71AX36，并结合LC-MS和NMR分析酶产物。在酵母中，该酶将costunolide转化为14-羟基costunolide，产物[M+H]+为249.2，保留时间5.6分钟；在烟草中则检测到该产物与半胱氨酸（[M+H]+=370.1）及谷胱甘肽（[M+H]+=556.2）的加合物。研究还首次提供了14-羟基costunolide的完整13C NMR归属（如C14 δ 58.7 ppm）。CYP71AX36也能氧化parthenolide生成14-羟基parthenolide（[M+H]+=265，保留时间4.86分钟），但效率较低，且不作用于非内酯化底物。该酶与已知的3β-羟化酶Tp8878有53%的氨基酸序列同一性。这一发现为倍半萜内酯类药物的结构修饰提供了新的酶工具，尤其在14-羟基化衍生物的生物合成方面具有应用潜力。
创新点
首次报道向日葵CYP71AX36作为costunolide 14α-羟化酶；提供14-羟基costunolide的完整2D-NMR归属和全部13C化学位移；发现该酶可接受parthenolide为底物，但不能作用于非内酯化底物。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 倍半萜内酯生物合成 | CYP71AX36 | CYP71AX36 | 催化 | 在酵母中催化costunolide C14位羟基化，生成14-羟基costunolide（[M+H]+=249.2，保留时间5.6 min） |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 倍半萜内酯生物合成 | CYP71AX36 | CYP71AX36 | 催化 | 在烟草中异源表达验证，产物以14-羟基costunolide-半胱氨酸和谷胱甘肽加合物形式检出 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 倍半萜内酯生物合成 | TpPTS | TpPTS | 催化 | parthenolide合成酶，用于测试CYP71AX36对parthenolide的底物活性 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 倍半萜内酯生物合成 | HaGAS1 | HaGAS1 | 催化 | germacrene A synthase，提供底物germacrene A |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 倍半萜内酯生物合成 | HaGAO | HaGAO | 催化 | germacrene A oxidase，参与germacrene A氧化为germacrene A acid |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 倍半萜内酯生物合成 | LsCOS | LsCOS | 催化 | costunolide synthase，催化costunolide生成 |
关键发现
- CYP71AX36在酵母中将costunolide转化为14-羟基costunolide，产物保留时间5.6 min，[M+H]+=249.2，ΔRT=9.6 min
- 在烟草中形成半胱氨酸加合物（[M+H]+=370.1）和谷胱甘肽加合物（[M+H]+=556.2）。CYP71AX36还能氧化parthenolide生成14-羟基parthenolide（[M+H]+=265，保留时间4.86 min，但强度很低），不能氧化germacrene A acid或8β-羟基germacrene A acid。与Tp8878（3β-羟化酶）有53%氨基酸序列同一性。首次给出14-羟基costunolide的完整13C NMR归属（如C14 δ 58.7 ppm）。
研究结论
CYP71AX36能够特异性催化costunolide的C14位羟基化，生成14-羟基costunolide，并且在酵母和烟草中均可功能表达。该酶还显示出对parthenolide的活性，暗示其在药物前体合成中的潜力。