A novel recombinant japanicin with dual antifungal and antiproliferative activities
- 作者
- Santhasiri Orrapin, Amornrat Intorasoot, Sittiruk Roytrakul, Nathupakorn Dechsupa, Jiraporn Kantapan, Yanika Onphat, Chutima Srimek, Chayada Sitthidet Tharinjaoren, Usanee Anukool, Bordin Butr-Indr, Ponrut Phunpae, Sorasak Intorasoot
- 杂志
- Scientific Reports（2019）
- DOI
- 10.1038/s41598-019-55044-7
- 所属领域
- 合成生物学
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解决的核心问题
针对耐药微生物和癌症的双重威胁，需要开发兼具抗真菌和抗增殖活性的新型治疗剂。本研究旨在从豆科植物种子中分离、鉴定并重组表达具有双重活性的防御素，以提供新的候选药物。
研究策略
利用3'RACE和cDNA克隆从五种豆科植物种子中分离防御素基因，通过生物信息学分析鉴定新序列；选择田菁（Sesbania javanica）防御素基因（javanicin）克隆到pTXB-1载体，在大肠杆菌Origami 2 (DE3)中表达intein-CBD融合蛋白，优化表达条件，通过几丁质亲和纯化获得目标肽，并测定其抗真菌、抗增殖及溶血活性。
核心内容
本研究从五种豆科植物种子中分离防御素基因，经3‘RACE和cDNA克隆获得五个新序列，并选择田菁防御素基因javanicin构建intein-CBD融合表达载体，在大肠杆菌Origami 2 (DE3)中实现可溶性表达。通过优化诱导条件（0.1 mM IPTG、25°C诱导6小时），融合蛋白约占菌体总蛋白28%；经几丁质亲和一步纯化，目标肽分子量约5.5 kDa，产量达2.5–3.5 mg/L，纯度超过90%。活性测定显示，重组javanicin对白念珠菌、氟康唑耐药白念珠菌、新生隐球菌和红色毛癣菌均有抑制作用，其中对新生隐球菌的最低抑菌浓度（MIC）为25 μg/ml；同时对人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231表现出增殖抑制活性，IC50分别为75–85 μg/ml和60–85 μg/ml，100 μg/ml时癌细胞死亡率超过85%。溶血活性在100 μg/ml时约10%，提示毒性可控。该研究首次报道了重组javanicin兼具抗真菌和抗肿瘤双重功能，为耐药真菌感染和癌症治疗提供了新的候选药物，也验证了intein-CBD系统在抗菌肽重组表达中的有效性。
创新点
['从五种豆科植物中首次分离并鉴定出五个新的防御素基因（GenBank登录号MH045506-MH045510）', '首次报道重组田菁防御素javanicin具有双重抗真菌和抗人乳腺癌细胞增殖活性', '利用intein-CBD融合系统在大肠杆菌中实现可溶性表达和一步纯化，产量和纯度较高']
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli Origami 2 (DE3) | 重组蛋白表达 | Javanicin defensin gene (Sesbania javanica) | Recombinant javanicin | 调控 | 重组表达的植物防御素，具有抗真菌和抗增殖活性，推测通过非膜破坏机制抑制真菌并通过凋亡诱导癌细胞死亡 |
| Escherichia coli Origami 2 (DE3) | 重组蛋白表达 | Intein-CBD (from pTXB-1 vector) | Intein-CBD fusion tag | 催化 | intein介导自剪接释放目标肽，CBD与几丁质亲和结合用于一步纯化 |
关键发现
- 从V. mungo、C. juncea、L. purpureus、S. javanica和C. gladiata种子中成功分离防御素基因。重组javanicin-intein融合蛋白分子量约34 kDa，占菌体总蛋白约28%
- 最佳诱导条件为0.1 mM IPTG、25°C诱导6 h。纯化后的目标肽分子量约5.5 kDa（预测质量5689.42 Da），产量2.5–3.5 mg/L，纯度>90%。抗真菌活性：对C. albicans ATCC 90028和氟康唑耐药C. albicans的MIC为100 μg/ml（完全抑制）和50 μg/ml（50%抑制），MMC为100 μg/ml
- 对C. neoformans的MIC为25 μg/ml，MMC为25 μg/ml
- 对T. rubrum的MIC为25 μg/ml（完全）和12.5 μg/ml（50%），MMC为50 μg/ml。未观察到抗菌活性。抗增殖活性：对MCF-7的IC50为75–85 μg/ml，对MDA-MB-231的IC50为60–85 μg/ml，100 μg/ml时癌细胞死亡率>85%。溶血活性：100 μg/ml时约10%溶血，200 μg/ml时约25%溶血。
研究结论
重组javanicin是一种具有双重抗真菌和抗人乳腺癌细胞增殖活性的新型植物防御素，对耐药真菌同样有效，且毒性可控，临床应用前景广阔。本研究为豆科防御素功能研究和抗菌肽在大肠杆菌中的重组表达提供了有效平台。