Molecular characterization and safety assessment of biofortified provitamin A rice
- 作者
- Norman Oliva, Maria Florida Cueto-Reano, Kurniawan R. Trijatmiko, Mercy Samia, Ralf Welsch, Patrick Schaub, Peter Beyer, Donald Mackenzie, Raul Boncodin, Russell Reinke, Inez Slamet-Loedin, B. P. Mallikarjuna Swamy
- 杂志
- Scientific Reports（2020）
- DOI
- 10.1038/s41598-020-57669-5
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
对维生素A原生物强化水稻（Golden Rice）事件GR2E进行全面的分子特征描述和安全性评估，包括插入DNA的拷贝数、完整性、遗传稳定性，以及新表达蛋白ZmPSY1和CRTI的潜在致敏性与毒性，以支持其作为安全食品的监管审批。
研究策略
采用Southern blot分析插入DNA的拷贝数与完整性，通过全长测序验证插入序列及旁侧序列；用生物信息学比对评估新表达蛋白及连接区新ORF与过敏原/毒素的同源性；通过模拟胃液消化实验、热稳定性实验和小鼠急性口服毒性实验评估蛋白安全性；并用ELISA测定蛋白表达量以估算膳食暴露量。
研究路线图
核心内容
该研究对维生素A原生物强化水稻（Golden Rice）事件GR2E进行了系统的分子特征鉴定与安全性评估。通过Southern blot和全长测序证实T-DNA以单拷贝形式插入水稻3号染色体基因间区，无质粒骨架残留，侧翼序列及插入序列共12772 bp，左右边界分别缺失11 bp和23 bp，且多代遗传稳定。在类胡萝卜素含量方面，不同遗传背景籽粒总类胡萝卜素为13.23至30.50 μg/g鲜重。针对新表达蛋白ZmPSY1和CRTI的评估显示，两者在模拟胃液中30秒内完全降解，热稳定性差（ZmPSY1在50°C、CRTI在55°C即完全失活），CRTI以100 mg/kg体重剂量口服未致小鼠不良效应；生物信息学比对未发现显著过敏原或毒素同源序列。估算每日最大膳食暴露量ZmPSY1约4.49 μg/kg体重、CRTI约0.85 μg/kg体重。综合证据表明该事件分子特征明确、遗传稳定，新表达蛋白缺乏致敏和毒性潜能，与传统水稻安全性相当，可支持其作为缓解维生素A缺乏症的食品安全监管审批。
创新点
首次系统报道Golden Rice事件GR2E的分子鉴定与安全性评估数据，包括单拷贝插入、无质粒骨架、多代稳定遗传，以及通过多重证据（序列相似性、消化稳定性、热敏感性、动物毒性）为新蛋白ZmPSY1和CRTI提供安全证据。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Oryza sativa (水稻) | 类胡萝卜素生物合成 | Zmpsy1 | ZmPSY1 | 催化 | 来源于玉米，催化GGPP生成15-顺式八氢番茄红素；受胚乳特异性GluA-2启动子调控。 |
| Oryza sativa (水稻) | 类胡萝卜素生物合成 | crtI (SSU-crtI融合基因) | CRTI | 催化 | 来源于Pantoea ananatis，催化八氢番茄红素去饱和生成番茄红素；N端融合豌豆RUBISCO SSU转运肽，受GluA-2启动子调控。 |
| Oryza sativa (水稻) | 选择标记/甘露糖代谢 | pmi | PMI | 催化 | 来源于大肠杆菌的磷酸甘露糖异构酶，用作转基因筛选标记；受组成型玉米多聚泛素启动子调控。 |
| Oryza sativa (水稻) | 蛋白质靶向转运 | SSU (豌豆RUBISCO小亚基转运肽编码序列) | SSU转运肽 | 区室化 | 引导CRTI蛋白进入质体以实现类胡萝卜素合成。 |
关键发现
- Southern blot证实GR2E基因组中T-DNA为单拷贝插入于单一基因座，未检测到质粒骨架序列
- HindIII消化产生约7900 bp（Zmpsy1/pmi探针）和约7200 bp（SSU-crtI探针）片段，SphI产生约6900 bp和约5500 bp片段。全长测序共确定12772 bp序列，包括5'侧翼1988 bp、3'侧翼1788 bp和插入T-DNA 8996 bp
- T-DNA左右边界分别缺失11 bp和23 bp，其余序列与pSYN12424质粒一致
- 插入位于水稻3号染色体LOC_Os03g43980与LOC_Os03g43990之间的基因间区。类胡萝卜素含量：Kaybonnet背景Tn代总类胡萝卜素为30.50±2.49 μg/g FWT
- BC5F5代在BRRI dhan29背景为29.33±3.14 μg/g FWT，在PSBRc82为14.12±0.11 μg/g FWT，IR64为13.23±1.16 μg/g FWT。ZmPSY1和CRTI蛋白在含胃蛋白酶的模拟胃液中30秒内即被降解，无完整蛋白残留。热稳定性：ZmPSY1在42°C孵育15分钟丧失50%活性，50°C完全失活
- CRTI在51°C丧失50%活性，55°C完全失活。CRTI蛋白以100 mg/kg体重单次口服给予小鼠，未观察到不良反应或死亡。估算每日最大膳食暴露量：ZmPSY1约4.49 μg/kg体重，CRTI约0.85 μg/kg体重，PMI约29.96 μg/kg体重。生物信息学分析显示ZmPSY1与过敏原/毒素无显著相似性
- CRTI仅与蛇毒L-氨基酸氧化酶的FAD结合区域有同源性，且该同源性在天然水稻PDS中也存在，不构成毒性风险。
研究结论
GR2E水稻的分子特征和蛋白质安全性评估结果表明，其插入DNA稳定且无有害效应，新表达蛋白无致敏性和毒性风险，与常规水稻同样安全，支持其用于缓解维生素A缺乏症。