Bioproduction of Linalool From Paper Mill Waste
- 作者
- Mauro A. Rinaldi, Shirley Tait, Helen S. Toogood, Nigel S. Scrutton
- 单位
- Future Biomanufacturing Research Hub, Manchester, United Kingdom; Manchester Institute of Biotechnology, The University of Manchester, Manchester, United Kingdom; C3 Biotechnologies (Maritime and Aerospace) Ltd, Lancaster, United Kingdom
- 杂志
- Frontiers in Bioengineering and Biotechnology（2022）
- DOI
- 10.3389/fbioe.2022.892896
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在规模化生物制造中，维护稳定、高产的微生物菌株具有挑战性。具体到利用大肠杆菌生物生产单萜芳樟醇时，存在质粒因重复序列导致重组而失稳、芳樟醇细胞毒性、发酵原料成本高等问题，本研究旨在通过多重靶向工程策略解决这些问题，并探索使用造纸厂废料作为低成本碳源。
研究策略
采用多靶向策略：1）消除质粒pMVA-GLinS中的重复序列R1-R3，构建稳定质粒pMVA-GLinS NR1/NR2；2）将芳樟醇合成途径分部分整合到大肠杆菌基因组（arsB、rbsAR、lacZ位点），摆脱抗生素依赖；3）通过适应性实验室进化（ALE）提高菌株对芳樟醇的耐受性；4）改造关键瓶颈酶GPPS/LinS（引入L72M、V214I突变，增加溶解度标签，构建融合蛋白，替换为NPPS等）；5）以造纸厂废水二次纸纤维为唯一碳源，进行同步糖化发酵（SSF），并测试添加商业纤维素酶或共表达分泌型纤维素酶的联合生物加工（CBP）方案。
核心内容
本研究以大肠杆菌DH5α为宿主，系统探索了芳樟醇生物合成中质粒稳定性、细胞耐受性和低成本碳源等关键瓶颈。研究发现原始质粒pMVA-GLinS中存在多个重复序列导致重组失稳，通过消除其中三个重复序列构建的NR2质粒使芳樟醇产量从122.7 mg/L提升至162.8 mg/L，提高1.7倍。将完整合成途径整合至基因组虽摆脱了抗生素依赖，但产量骤降至质粒系统的约百分之一。适应性实验室进化虽使菌株耐受性提升至20 g/L芳樟醇，但并未提高产量，揭示耐受性与生产能力在该体系中无正相关性。研究最终证明以造纸厂废纸纤维为唯一碳源、添加商业纤维素酶进行同步糖化发酵可获得优于葡萄糖培养的产量，共表达分泌型纤维素酶亦支持菌株生长。这些结果表明不同工程策略需针对具体生产体系定制优化，同时为利用工业废弃物实现低成本单萜生物制造提供了概念验证。
创新点
1. 系统鉴定了pMVA-GLinS质粒中四个重复序列（R1-R3等），通过消除其中三个使质粒稳定性显著提高，产量提升1.7倍；2. 首次将芳樟醇完整合成途径整合到E. coli DH5α基因组中（菌株MGL），但产量大幅下降；3. 证实ALE可大幅提高芳樟醇耐受性（最高20 g/L）但未能提高产量，揭示了该策略在不同体系中的局限性；4. 证明以造纸厂废纸纤维为唯一碳源可实现芳樟醇生产，且SSF产量高于葡萄糖培养；5. 展示了共表达分泌型纤维素酶实现联合生物加工的可行性。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | 甲羟戊酸（MVA）途径（上游） | EcAtoB, SaHMGS, SaHMGR | EcAtoB, SaHMGS, SaHMGR | 催化 | 乙酰-CoA乙酰转移酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶，由质粒pMVA或基因组整合于rbsAR位点表达 |
| Escherichia coli DH5α | 甲羟戊酸（MVA）途径（下游） | ScMK, ScPMK, ScPMD, EcIDI | ScMK, ScPMK, ScPMD, EcIDI | 催化 | 甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、IPP异构酶，由质粒或基因组整合于lacZ位点表达 |
| Escherichia coli DH5α | 芳樟醇合成途径 | AgGPPS, linS | AgGPPS, LinS | 催化 | 冷杉香叶基焦磷酸合酶和链霉菌芳樟醇合酶，LinS存在L72M、V214I等突变体及融合蛋白形式 |
| Escherichia coli DH5α | 芳樟醇合成途径（替代） | NPPS | NPPS | 催化 | 番茄橙花基焦磷酸合酶，用于替代或与GPPS共表达以改变前体供给 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 纤维素降解 | 纤维素酶基因（来自pCellulose质粒） | 纤维素酶复合体 | 催化 | 通过pCellulose质粒共表达分泌型纤维素酶，实现联合生物加工（CBP） |
关键发现
- 原始质粒pMVA-GLinS系统芳樟醇产量为122.7±48.6 mg/L，双质粒系统（pMVA+pGLinS）为4.90±4.5 mg/L
- 消除重复序列后NR2构建体产量为162.8±37.1 mg/L，相比原始提高1.7倍，且非产菌落比例降低。基因组整合菌株GL几乎无产量，M1（MVA途径整合+质粒GLinS）产量为4.51±3.68 mg/L，完全整合菌株MGL产量为2.32±0.84 mg/L，约为质粒系统的1/100。ALE进化菌株可在20 g/L芳樟醇下存活，在5 g/L芳樟醇下ALE-20生长量约为无芳樟醇时的70%，而野生型仅约10%
- 但所有ALE菌株的芳樟醇产量均低于野生型。以造纸厂废纸纤维为碳源时，添加Cellic cTec2纤维素酶可实现SSF，产量高于以葡萄糖为唯一碳源
- 共表达pCellulose质粒纤维素酶也能支持菌株生长。
研究结论
本研究证明消除质粒重复序列是提高芳樟醇生产稳定性和产量的关键因素，而基因组整合、ALE耐受性进化、关键酶改造等策略在该体系中未能产生正向效果，表明不同生产系统需针对性优化。同时，成功利用造纸厂废纸纤维作为唯一碳源进行同步糖化发酵和联合生物加工，为低成本生物制造提供了概念验证。未来需要更全面的菌株工程和发酵过程开发以实现规模化生产。