Development of screening methods for functional characterization of UGTs from Stevia rebaudiana
- 作者
- Eva Petit, Monique Berger, Laurent Camborde, Veronica Vallejo, Jean Daydé, Alban Jacques
- 杂志
- Scientific Reports（2020）
- DOI
- 10.1038/s41598-020-71746-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
甜菊醇糖苷生物合成途径中UGT的功能大多未知，缺乏简便的功能表征方法。
研究策略
利用农杆菌浸润在烟草叶片中瞬时表达候选UGT（如UGT76G1），结合GFP标签，开发基于粗酶提取物的体外活性检测和直接浸润底物的体内活性检测两种方法来评估酶功能。
核心内容
该研究针对甜菊醇糖苷生物合成途径中多数糖基转移酶（UGT）功能未知、缺乏简便表征方法的问题，以甜菊UGT76G1为对象，建立了基于农杆菌浸润烟草叶片瞬时表达的体外和体内两种UGT功能筛选方法。借助pGWBs系列载体，同一载体同时用于活性检测、亚细胞定位和蛋白纯化，无需纯化蛋白即可评估酶活性。结果显示UGT76G1在烟草中成功表达，分子量约77 kDa，重组蛋白主要定位于细胞质和细胞核，C端GFP融合蛋白积累量高于N端；GFP或6×His标签不影响其β-1,3-糖基化活性。体内实验中，非转化烟草不能将甜菊苷转化为莱鲍迪苷A，而表达UGT76G1的烟草可催化该反应。以含甜菊苷和Dulc A的粗提物为底物时，UGT76G1将7.8%±1.3%的甜菊苷转化为莱鲍迪苷A，73.5%±4.9%的Dulc A转化为莱鲍迪苷C，并推测可产生莱鲍迪苷F。这些结果证实了两种方法能有效筛选甜菊UGT功能，且可推广至其他植物UGT研究，为阐明甜菊醇糖苷生物合成途径提供了简便工具。
创新点
开发了两种无需纯化蛋白的UGT功能鉴定方法；可在植物体内或粗提物中快速筛选底物；利用pGWBs系列载体实现同一载体用于活性检测、亚细胞定位和蛋白纯化。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana | 甜菊醇糖苷生物合成 | UGT76G1 | UGT76G1 | 催化 | 瞬时表达重组UGT76G1，验证其催化ST生成RebA的活性。 |
| Nicotiana benthamiana | 甜菊醇糖苷生物合成 | UGT76G1-GFP | UGT76G1-GFP | 催化 | C端融合GFP，不影响酶活性。 |
| Nicotiana benthamiana | 甜菊醇糖苷生物合成 | GFP-UGT76G1 | GFP-UGT76G1 | 催化 | N端融合GFP，蛋白质积累量较低，但仍有活性。 |
| Nicotiana benthamiana | 甜菊醇糖苷生物合成 | UGT76G1-6xHis | UGT76G1-6xHis | 催化 | 组氨酸标签不影响活性。 |
| Stevia rebaudiana (基因型E) | 甜菊醇糖苷生物合成 | UGT76G1 | UGT76G1（内源无功能） | 催化 | 基因型E的UGT76G1无功能，不产生RebA和RebC，用于提取含ST和DulcA的底物混合物。 |
关键发现
- UGT76G1在烟草中成功表达，分子量约77 kDa
- Western blot显示C端GFP融合蛋白积累量高于N端
- 共聚焦显微镜显示重组蛋白主要定位于细胞质和细胞核
- 非转化烟草不能将甜菊苷（ST）转化为莱鲍迪苷A（Reb A）
- 表达UGT76G1的烟草能够催化ST生成Reb A
- GFP或6×His标签不影响UGT76G1的β-1,3-糖基化活性
- 以基因型E的粗提物（含ST和Dulc A）为底物时，UGT76G1催化7.8%±1.3%的ST转化为Reb A，73.5%±4.9%的Dulc A转化为Reb C，并推测能产生Reb F。
研究结论
本研究建立的体外和体内活性检测方法可有效筛选甜菊UGT的功能，为阐明甜菊醇糖苷生物合成途径提供了简便工具，且该方法适用于其他植物UGT的功能研究。