Compartmentalization engineering of yeasts to overcome precursor limitations and cytotoxicity in terpenoid production
- 作者
- Lifei Chen, Wenhai Xiao, Mingdong Yao, Ying Wang, Yingjin Yuan
- 单位
- Frontier Science Center for Synthetic Biology and Key Laboratory of Systems Bioengineering (Ministry of Education), School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin, China; Georgia Tech Shenzhen Institute, Tianjin University, Shenzhen, China
- 杂志
- Frontiers in Bioengineering and Biotechnology（2023）
- DOI
- 10.3389/fbioe.2023.1132244
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
萜类化合物生产中普遍存在前体（如GPP、FPP、乙酰辅酶A）供应不足、产物细胞毒性以及疏水性产物储存空间有限等问题，限制了酵母中萜类化合物的高效合成。
研究策略
利用真核细胞器（线粒体、过氧化物酶体、脂滴、内质网、细胞膜等）进行区室化工程，将萜类生物合成途径或关键酶靶向定位到特定细胞器，以隔离竞争反应、提高局部底物和酶浓度、降低产物毒性并提供适宜的储存环境；同时结合细胞器形态工程（增大体积、增加数量）和多细胞器协同工程来进一步提升产量。
核心内容
该研究系统总结了酵母中通过细胞器区室化工程克服萜类合成中前体供应不足、产物细胞毒性和储存空间受限等瓶颈的策略。研究者将MVA途径或关键酶（如FPP合酶、倍半萜合酶）分别靶向线粒体、过氧化物酶体、脂滴、内质网和细胞膜等细胞器，以隔离竞争反应、提高局部底物浓度并降低毒性，同时结合过氧化物酶体增殖、脂滴体积扩大、内质网扩张等形态工程以及多细胞器协同定位进一步优化合成。关键结果包括：将FPP合酶和倍半萜合酶靶向线粒体使朱栾倍半萜和青蒿二烯产量分别提高8倍和20倍；在过氧化物酶体中重建MVA途径使GPP衍生化合物产量比细胞质途径提高125倍；将β-胡萝卜素酮化酶和羟化酶融合靶向细胞膜使虾青素产量提高215.4%；靶向脂滴并扩大体积使人参皂苷CK滴度达5 g/L。该工作表明区室化工程可显著提升酵母中多种萜类化合物的生产水平，为后续开发新细胞器及耦合辅因子工程提供了方向。
创新点
系统总结了不同细胞器区室化策略在单萜、倍半萜、三萜和四萜类生产中的应用，提出了通过调控细胞器形态（如过氧化物酶体和脂滴的增殖、内质网扩张）以及多细胞器同时定位来优化萜类合成的创新思路。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径/倍半萜合成 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 靶向线粒体以提高FPP供给，使缬草烯和青蒿二烯产量分别提升8倍和20倍 |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径 | — | MVA途径酶 | 催化 | 完整MVA途径区室化至线粒体，α-檀香烯产量提高3.7倍 |
| Saccharomyces cerevisiae | 过氧化物酶体形态调控 | PEX11 | 过氧化物酶体增殖相关蛋白 | 调控 | 敲除PEX11使过氧化物酶体增大和聚集，用于原人参二醇生产 |
| Saccharomyces cerevisiae | 过氧化物酶体形态调控 | PEX34 | 过氧化物酶体增殖调控蛋白 | 调控 | 过表达PEX34增加过氧化物酶体数量，提高原人参二醇产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 过氧化物酶体自噬 | ATG36 | 自噬相关蛋白 | 调控 | 敲除ATG36抑制过氧化物酶体自噬，提升香叶醇产量80% |
| Saccharomyces cerevisiae | 脂质代谢/脂滴合成 | DGA1 | 二酰甘油酰基转移酶 | 催化 | 过表达DGA1增大脂滴体积，促进番茄红素和人参皂苷积累 |
| Saccharomyces cerevisiae | 脂质代谢/脂滴合成 | PAH1 | 磷脂酸磷酸酶 | 催化 | 调控脂滴和膜生物合成，影响萜类储存 |
| Saccharomyces cerevisiae | 内质网扩张 | INO2 | 磷脂生物合成转录激活因子 | 调控 | 过表达INO2扩大内质网面积，角鲨烯产量达634 mg/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 线粒体形态与代谢 | FIS1 | 线粒体分裂蛋白 | 调控 | 过表达FIS1促进线粒体分裂，增强线粒体区室化途径 |
| Saccharomyces cerevisiae | 虾青素合成 | CrtW, CrtZ | β-胡萝卜素酮化酶, β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 融合蛋白靶向细胞膜，虾青素产量提高215.4% |
| Saccharomyces cerevisiae | 三萜合成 | PPDS | 原人参二醇合酶 | 催化 | 靶向脂滴消除底物分离，DD到PPD转化率从17.4%提高到86.0% |
| Yarrowia lipolytica | 萜类合成 | — | α-蛇麻烯合酶 | 催化 | 利用过氧化物酶体乙酰辅酶A库，α-蛇麻烯产量达3.2 g/L |
关键发现
- 将FPP合酶和倍半萜合酶靶向线粒体，使朱栾倍半萜和青蒿二烯产量分别提高8倍和20倍
- 将完整MVA途径区室化到线粒体，α-檀香烯产量提高3.7倍
- 在过氧化物酶体中重建MVA途径，GPP衍生化合物产量比细胞质途径提高125倍
- 将香叶醇生物合成酶靶向过氧化物酶体，香叶醇滴度提高80%（达2.75 mg/L）
- 将β-胡萝卜素酮化酶和羟化酶融合靶向细胞膜，虾青素产量提高215.4%
- 将PPDS靶向脂滴并扩大脂滴体积，DD到PPD转化率从17.4%提高到86.0%，人参皂苷CK滴度达5 g/L（5L发酵）
- 通过线粒体和细胞质双工程，角鲨烯产量达21.1 g/L
- 在解脂耶氏酵母中同时靶向脂滴、内质网和过氧化物酶体表达虾青素途径，产量达858 mg/L
- 过表达AIM25使桧烯产量达154.9 mg/L
- 过表达INO2使角鲨烯产量达634 mg/L。
研究结论
细胞器区室化工程通过优化前体供给、降低细胞毒性、提供储存空间和缩小酶与底物空间距离，显著提升了酵母中多种萜类化合物的生产水平；未来可探索高尔基体、液泡等新细胞器，并耦合辅因子工程以进一步提高产量。