Multiplicity of carotene patterns derives from competition between phytoene desaturase diversification and biological environments
- 作者
- Mathieu Fournié, Gilles Truan
- 杂志
- Scientific Reports（2020）
- DOI
- 10.1038/s41598-020-77876-4
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
研究八种CrtI类八氢番茄红素脱氢酶在不同生物环境下的脱饱和模式差异，以及其与系统发育和动力学特性的关系。
研究策略
构建28个CrtI酶的系统发育树，在标准化条件下于大肠杆菌中表达8个CrtI酶，利用粗提物和纯化酶进行体外脱饱和反应及动力学分析，并在酿酒酵母中重构β-胡萝卜素通路以研究番茄红素环化酶对脱饱和模式的竞争影响。
核心内容
本研究系统比较了八种来源于不同生物的CrtI类八氢番茄红素脱氢酶在脱饱和模式上的多样性及其与系统发育和动力学特性的关系。研究者构建了28个CrtI酶的系统发育树，在大肠杆菌中标准化表达8个CrtI酶，并通过粗提物和纯化酶进行体外脱饱和反应及动力学分析，同时在酿酒酵母中重构β-胡萝卜素通路以考察环化酶对脱饱和模式的竞争影响。结果显示，体外60小时反应中I4_Ea和I5_Nc可催化六步脱饱和形成四脱氢番茄红素，首次扩展了已知的CrtI脱饱和能力；动力学分析揭示各酶Kd值变化达100倍、kcat值变化达300倍，且产物模式主要由反应速率差异而非底物亲和力决定。系统发育上，3步和5步脱饱和酶分别具有至少66%和47%的序列同一性，而4步脱饱和酶同一性可低至27%。在酵母中，脱饱和与环化步骤的竞争显著改变终产物，如I4_Bt在无环化酶时产生二脱氢番茄红素，有环化酶时完全转向β-胡萝卜素。该研究表明CrtI酶的实际产物模式不能仅从系统发育推断，而由进化相关的反应速率变化与环化竞争共同决定，为类胡萝卜素途径的理性设计和调控提供了重要依据。
创新点
['首次在体外证明I4_Ea和I5_Nc可催化六步脱饱和形成四脱氢番茄红素，扩展了CrtI酶已知的脱饱和能力。', '建立了标准化、可比较的CrtI酶活性测定方法，揭示CrtI酶的底物谱与产物分布具有更大的灵活性。', '通过动力学建模首次获得CrtI酶各步脱饱和反应的Kd和kcat值，证明产物模式主要由反应速率变化而非底物亲和力决定。']
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素生物合成（八氢番茄红素脱饱和） | crtI (I3_Rc) | 八氢番茄红素脱饱和酶 CrtI (来自Rhodobacter capsulatus) | 催化 | 体外表达、纯化和动力学分析，可催化至六步脱饱和 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素生物合成（八氢番茄红素脱饱和） | crtI (I3_Rs) | 八氢番茄红素脱饱和酶 CrtI (来自Rhodobacter sphaeroides) | 催化 | 体外表达及酵母体内实验，产物以植物烯为主 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素生物合成（八氢番茄红素脱饱和） | crtI (I4_Rr) | 八氢番茄红素脱饱和酶 CrtI (来自Rubrivivax gelatinosus) | 催化 | 体外表达，产生番茄红素 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素生物合成（八氢番茄红素脱饱和） | crtI (I4_Ea) | 八氢番茄红素脱饱和酶 CrtI (来自Erwinia uredovora) | 催化 | 体外表达，可进行六步脱饱和形成四脱氢番茄红素 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素生物合成（八氢番茄红素脱饱和） | crtI (I4_Pa) | 八氢番茄红素脱饱和酶 CrtI (来自Pantoea ananatis) | 催化 | 体外表达，可产生四脱氢番茄红素，与I4_Ea具有相似动力学特征 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素生物合成（八氢番茄红素脱饱和） | crtI (I4_Ma) | 八氢番茄红素脱饱和酶 CrtI (来自Myxococcus xanthus) | 催化 | 体外表达，产生的番茄红素仅占总脱饱和产物约10% |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素生物合成（八氢番茄红素脱饱和） | crtI (I4_Bt) | 八氢番茄红素脱饱和酶 CrtI (来自Blakeslea trispora) | 催化 | 体外表达及酵母体内实验，无环化酶时可形成二脱氢番茄红素 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素生物合成（八氢番茄红素脱饱和） | crtI (I5_Nc) | 八氢番茄红素脱饱和酶 CrtI (来自Neurospora crassa) | 催化 | 体外表达，可进行六步脱饱和形成四脱氢番茄红素，酵母中与环化酶共表达产生圆酵母红素 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 (YHR01/YHR02) | β-胡萝卜素生物合成途径 | crtYB | 双功能八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶 CrtYB (来自Phaffia rhodozyma) | 催化 | YHR01仅含八氢番茄红素合成酶活性（截短），YHR02全长为双功能酶，提供番茄红素环化酶活性以形成β-胡萝卜素和圆酵母红素等单环和双环类胡萝卜素 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 (YHR01/YHR02) | 类异戊二烯前体供给（甲羟戊酸途径） | crtE, HMG1 | GGPP合酶 (CrtE) 和截短HMG-CoA还原酶 (tHMG1) | 催化 | 过表达以增强GGPP合成和甲羟戊酸途径的通量，为类胡萝卜素合成提供前体 |
关键发现
- 3步和5步脱饱和酶分别至少66%和47%的序列同一性，而4步脱饱和酶序列同一性可低至27%。在60小时体外反应中，I3_Rc产生番茄红素，I4_Pa产生二脱氢番茄红素和四脱氢番茄红素，I4_Ea和I5_Nc能进行六次脱饱和形成四脱氢番茄红素。动力学分析显示各酶Kd值变化范围达100倍，kcat值变化范围达300倍。I4_Pa和I4_Ea产生的番茄红素占脱饱和产物75%以上，而I4_Ma仅占10%。在酵母中，I3_Rs与番茄红素环化酶共表达时产生β-玉米胡萝卜素，I5_Nc产生圆酵母红素，I4_Bt产生γ-胡萝卜素
- 无环化酶时I4_Bt可产生二脱氢番茄红素，有环化酶时完全消失并转向β-胡萝卜素。
研究结论
CrtI酶在体外可催化超过自然宿主中观察到的脱饱和程度，其实际产物模式不能仅从系统发育分类推断，而是由进化相关的反应速率变化以及脱饱和与环化步骤之间的竞争共同决定。