Cloning, characterization, and functional analysis of acetyl-CoA C-acetyltransferase and 3-hydroxy-3-methyl lutaryl-CoA synthase genes in Santalum album
- 作者
- Meiyun Niu, Haifeng Yan, Yuping Xiong, Yueya Zhang, Xinhua Zhang, Yuan Li, Jaime A. Teixeira da Silva, Guohua Ma
- 杂志
- Scientific Reports（2021）
- DOI
- 10.1038/s41598-020-80268-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
为理解檀香醇生物合成机制，克隆并功能分析印度檀香（Santalum album）中甲羟戊酸（MVA）途径的两个关键酶基因——乙酰CoA C-乙酰转移酶（AACT）和3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合酶（HMGS）。
研究策略
采用RACE技术克隆SaAACT和SaHMGS全长cDNA；通过生物信息学分析蛋白特性、保守结构域和系统进化；用酵母突变株进行功能互补验证；利用拟南芥原生质体进行亚细胞定位；通过qRT-PCR分析组织表达模式及100 μM MeJA诱导下的表达变化。
研究路线图
核心内容
该研究首次在印度檀香中克隆并功能表征了甲羟戊酸途径上游的两个关键酶基因SaAACT和SaHMGS。通过RACE技术获得全长cDNA，其中SaAACT编码415个氨基酸，蛋白分子量43.13 kDa；SaHMGS编码470个氨基酸，蛋白分子量51.99 kDa。酵母突变株功能互补实验证实两者均编码具有催化活性的功能酶。亚细胞定位和qRT-PCR分析显示两基因在所有组织中组成型表达，且均在根中表达量最高，SaAACT在根中的表达量分别达到幼叶的13.44倍，SaHMGS为幼叶的4.22倍。经100 μM茉莉酸甲酯处理后，两基因在根、茎、叶中的转录水平均显著上调，其中SaAACT在处理后24小时达到峰值。这些结果揭示SaAACT和SaHMGS是檀香MVA途径中受茉莉酸信号调控的功能性关键酶，其在根和心材中的高表达暗示可能参与檀香倍半萜（尤其是檀香醇）的生物合成调控，为后续通过基因工程手段提高檀香醇产量提供了重要的分子资源和理论依据。
创新点
首次在印度檀香中克隆并表征MVA途径上游基因SaAACT和SaHMGS，并完成了酵母功能互补、亚细胞定位和表达谱分析，填补了檀香倍半萜生物合成上游途径研究的空白。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸（MVA）途径 | SaAACT | 乙酰CoA C-乙酰转移酶（AACT） | 催化 | 酵母突变株YPL028W（ΔERG10）中异源表达，功能互补验证其催化乙酰CoA缩合生成乙酰乙酰CoA。 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸（MVA）途径 | SaHMGS | 3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合酶（HMGS） | 催化 | 酵母突变株YML126C（ΔERG13）中异源表达，功能互补验证其催化乙酰CoA与乙酰乙酰CoA缩合生成3-羟基-3-甲基戊二酰CoA。 |
关键发现
- SaAACT全长cDNA为1538 bp，含1248 bp ORF，编码415个氨基酸，蛋白分子量43.13 kDa
- SaHMGS全长cDNA为1807 bp，含1413 bp ORF，编码470个氨基酸，蛋白分子量51.99 kDa。SaAACT与油茶、长春花AACT的核苷酸同源性为80%，与毛果杨、泽漆、橡胶树为79-78%
- SaHMGS与茶树、人参、橡胶树、罗汉果HMGS同源性均为82%，与桔梗为81%。酵母功能互补证明SaAACT和SaHMGS编码有功能的AACT和HMGS。组织表达分析显示两基因在所有组织中组成型表达，SaAACT在根中表达量最高，分别为幼叶的13.44倍、成熟叶的3.66倍、心材的3.55倍
- SaHMGS在根中表达量最高，为幼叶的4.22倍。100 μM MeJA处理后，SaAACT和SaHMGS在根、茎、叶中的转录水平均显著上调，SaAACT在处理后24 h达到峰值。
研究结论
SaAACT和SaHMGS是檀香MVA途径中具有催化功能的关键酶基因，在根和心材中高表达，且受MeJA诱导，可能参与檀香倍半萜（尤其是檀香醇）的生物合成调控，为深入理解檀香醇生物合成分子机制和通过基因工程提高檀香醇含量提供了分子资源。