Kinetic studies and homology modeling of a dual-substrate linalool/nerolidol synthase from Plectranthus amboinicus
- 作者
- Nur Suhanawati Ashaari, Mohd Hairul Ab. Rahim, Suriana Sabri, Kok Song Lai, Adelene Ai-Lian Song, Raha Abdul Rahim, Janna Ong Abdullah
- 杂志
- Scientific Reports（2021）
- DOI
- 10.1038/s41598-021-96524-z
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
解析来自左手香的底物双特异性芳樟醇/橙花叔醇合酶(PamTps1)的生化特性及结构基础，阐明其如何利用GPP和FPP两种底物进行催化。
研究策略
通过生化表征(最适pH、温度、金属离子依赖)、Michaelis-Menten动力学分析、同源建模(以BPPS为模板)和分子对接，揭示PamTps1的催化特性、活性位点结构及双底物识别的结构基础。
核心内容
研究者对来自左手香的芳樟醇/橙花叔醇双底物合酶PamTps1进行了系统的生化与结构表征。酶学分析显示该酶最适pH为6.5，最适温度30°C，Mg2+最佳浓度为20 mM，而Mn2+虽在0.5 mM时达到最佳但催化活性仅为Mg2+的约2.1倍。动力学测定表明，以GPP为底物时Km为16.72 μM，kcat/Km为9.57×10-3 μM-1s-1，以FPP为底物时Km为40.47 μM，kcat/Km为2.47×10-3 μM-1s-1，说明该酶对较短链的GPP具有更高的亲和力与催化效率。通过以BPPS为模板的同源建模，研究者构建了高质量的PamTps1三维结构模型（GMQE=0.82，ERRAT=95.88%），并借助分子对接鉴定了活性位点中一系列可容纳较长FPP底物的芳香族残基（如W268、Y272、Y299、F371等）以及由RRx8W、RxR、H-α1和J-K环组成的活性腔盖子。结果表明PamTps1属于典型的I类萜烯合酶，其活性腔具有足够空间容纳FPP，这从结构层面解释了该酶的双底物特异性。该模型为通过理性设计改造单萜/倍半萜合酶的底物选择性提供了结构框架。
创新点
首次构建了PamTps1的三维同源模型并解析其双底物识别的结构基础；鉴定出活性位点中可容纳较长链FPP的芳香族残基(W268、Y272、Y299、F371、Y378、Y379、F447、Y517和Y523)以及RRx8W、RxR、H-α1和J-K环组成的活性位点盖子等关键结构特征。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli Rosetta 2 (DE3) | 异源萜类合成 | PamTps1 | PamTps1 (芳樟醇/橙花叔醇合酶) | 催化 | 用于重组表达和功能表征 |
| Plectranthus amboinicus | 植物萜烯生物合成(MEP/MVA途径) | PamTps1 | PamTps1 (芳樟醇/橙花叔醇合酶) | 催化 | 来源植物，酶基因分离自该植物 |
关键发现
- PamTps1最适pH为6.5，最适温度为30°C，Mg2+最适浓度为20 mM，Mn2+最适浓度为0.5 mM但催化活性较Mg2+低2.1倍。以GPP为底物时Km=16.72±1.32 μM，kcat=0.16 s-1，kcat/Km=9.57×10-3 μM-1s-1，Vmax=24.16±3.75 μmol mg-1
- 以FPP为底物时Km=40.47±3.83 μM，kcat=0.10 s-1，kcat/Km=2.47×10-3 μM-1s-1，Vmax=14.85±2.80 μmol mg-1。同源模型GMQE=0.82，QMEAN Z-score=-1.32，PROCHECK显示92.8%残基在最适区，ERRAT=95.88%，Verify3D=95.73%，ProSA Z-score=-12，与模板BPPS的α-碳RMSD=0.203 Å。
研究结论
PamTps1是典型的I类萜烯合酶，对GPP有更高的亲和力和催化效率；其活性腔足够大且不受空间限制，可容纳FPP，从而解释了其双底物特异性。该模型为通过理性设计改造单萜/倍半萜合酶功能提供了框架。