Enzymes of an alternative pathway of glucose metabolism in obligate methanotrophs
- 作者
- Olga N. Rozova, Galina A. Ekimova, Nikolai V. Molochkov, Alexander S. Reshetnikov, Valentina N. Khmelenina, Ildar I. Mustakhimov
- 单位
- Research Center of Biotechnology, Russian Academy of Sciences; G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences
- 杂志
- Scientific Reports（2021）
- DOI
- 10.1038/s41598-021-88202-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
揭示严格甲烷氧化菌虽不能利用糖类生长，但体内存在葡萄糖脱氢酶和葡萄糖酸激酶组成的糖代谢旁路及其生理功能
研究策略
克隆表达并纯化来自 Methylotuvimicrobium alcaliphilum 20Z 和 Methylobacter luteus IMV-B-3098 的葡萄糖脱氢酶（GDH）与葡萄糖酸激酶（GntK），进行酶学表征；通过构建 gdh/glk 和 gntk/glk 双突变株分析胞内糖类代谢物变化；结合生物信息学分析验证体内功能
核心内容
该研究针对严格甲烷氧化菌中糖类代谢的长期疑问，系统解析了葡萄糖脱氢酶（GDH）与葡萄糖酸激酶（GntK）组成的葡萄糖酸支路及其生理功能。研究者从Methylotuvimicrobium alcaliphilum 20Z和Methylobacter luteus IMV-B-3098中克隆、表达了两种GDH和GntK并进行酶学表征，发现MtmGDH最适pH 10，葡萄糖Km高达91.8 mM；MbGDH最适pH 8.5，Km为16 mM。通过构建gdh/glk和gntk/glk双突变株，发现突变株以甲烷生长时胞内葡萄糖分别升高50倍和32倍，糖原含量分别降低约690倍和111倍，双突变株生长速率比野生型慢1.5倍。结果表明，糖原降解产生的游离葡萄糖经GDH和GntK进入Entner-Doudoroff途径或磷酸戊糖循环，形成绕过糖酵解的葡萄糖酸支路。该支路在维持胞内葡萄糖稳态和糖原代谢中发挥关键回补作用，但不支持外源糖类利用，揭示了严格甲烷氧化菌糖代谢网络的新层次。
创新点
['首次在革兰氏阴性严格甲烷氧化菌中表征NAD(P)+依赖的葡萄糖脱氢酶和葡萄糖酸激酶', '发现Mtm. alcaliphilum GDH具有迄今最高的葡萄糖Km值（92 mM）', '通过双突变株证实GDH/GntK组成的葡萄糖酸支路将糖原代谢与Entner-Doudoroff途径相连']
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Methylotuvimicrobium alcaliphilum 20Z | 葡萄糖代谢旁路（葡萄糖酸支路）/Entner-Doudoroff途径 | gdh (CCE23386) | 葡萄糖脱氢酶 (MtmGDH) | 催化 | NAD(P)+依赖的D-葡萄糖氧化为D-葡萄糖酸-1,5-内酯；最适pH 10，Vmax 95 U/mg (NAD+)，葡萄糖Km 92 mM |
| Methylobacter luteus IMV-B-3098 | 葡萄糖代谢旁路（葡萄糖酸支路）/Entner-Doudoroff途径 | gdh (WP_027157932) | 葡萄糖脱氢酶 (MbGDH) | 催化 | 最适pH 8.5，葡萄糖Km 16 mM，Vmax 43 U/mg (NADP+) |
| Methylotuvimicrobium alcaliphilum 20Z | 葡萄糖酸支路 | gntK (CCE23379) | 葡萄糖酸激酶 (MtmGntK) | 催化 | 催化葡萄糖酸磷酸化为6-磷酸葡萄糖酸；Vmax 25.8 U/mg，葡萄糖酸Km 0.6 mM，ATP S0.5 1.3 mM (n=1.6) |
| Methylobacter luteus IMV-B-3098 | 葡萄糖酸支路 | gntK (WP_051299846) | 葡萄糖酸激酶 (MbGntK) | 催化 | Vmax 56.1 U/mg，葡萄糖酸Km 0.24 mM，ATP S0.5 0.042 mM (n=2.3) |
| Methylotuvimicrobium alcaliphilum 20Z | 糖原代谢/糖酵解 | glk | 葡萄糖激酶 (Glk) | 催化 | 参与糖原降解来源葡萄糖的磷酸化；单glk突变株糖原水平较野生型降低约50倍；本研究中构建gdh/glk和gntk/glk双突变株 |
| Methylotuvimicrobium alcaliphilum 20Z | 海藻糖合成 | treY, treZ, treS | 麦芽寡糖基海藻糖合酶、海藻糖水解酶、海藻糖合酶 | 催化 | 基因组预测参与由糖原/麦芽糊精合成海藻糖 |
| Methylotuvimicrobium alcaliphilum 20Z | 糖原降解 | glgP, glgX, malQ | 糖原磷酸化酶、脱支酶、4-α-葡聚糖转移酶 | 催化 | 参与糖原分解产生游离葡萄糖和麦芽糊精 |
关键发现
- Mtm. alcaliphilum GDH最适pH 10，Vmax(NAD+)为95 U/mg蛋白，葡萄糖Km为91.8±3.8 mM
- Mb. luteus GDH最适pH 8.5，Vmax(NAD+)为31 U/mg蛋白，葡萄糖Km为16±0.6 mM。MtmGntK Vmax为25.8 U/mg蛋白，葡萄糖酸Km为0.6 mM
- MbGntK Vmax为56.1 U/mg蛋白，葡萄糖酸Km为0.24 mM。gdh/glk突变株以甲烷或甲醇生长时胞内葡萄糖分别升高50倍和32倍，糖原含量分别降低690倍（甲烷）和约66倍（甲醇）。gntk/glk突变株积累葡萄糖酸（甲烷0.83，甲醇1.30 mg/g DCW），且糖原降低（甲烷下约111倍，甲醇下约5.8倍）。双突变株生长速率比野生型慢1.5倍。
研究结论
严格甲烷氧化菌中，由糖原降解产生的游离葡萄糖可通过GDH和GntK进入Entner-Doudoroff途径或磷酸戊糖循环，绕过糖酵解形成葡萄糖酸支路。该支路在维持胞内葡萄糖稳态、糖原代谢以及应对甲烷缺乏时可能发挥回补作用，但不支持细菌利用外源糖类生长。