5-Azacytidine increases tanshinone production in Salvia miltiorrhiza hairy roots through epigenetic modulation
- 作者
- Bo-Cheng Yang, Meng-Shiou Lee, Ming-Kuen Lin, Wen-Te Chang
- 杂志
- Scientific Reports（2022）
- DOI
- 10.1038/s41598-022-12577-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
探究DNA甲基化（表观遗传调控）对丹参毛状根中次生代谢产物丹参酮合成的影响机制，尤其是5-氮杂胞苷通过改变CPS启动子区域甲基化状态促进丹参酮积累的分子机制。
研究策略
使用DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷处理丹参毛状根，通过HPLC检测代谢物含量、qRT-PCR检测通路基因表达、全局DNA甲基化水平测定、重亚硫酸盐测序结合NGS分析CPS启动子甲基化状态，并利用PLANTPAN3.0预测去甲基化位点上的转录因子结合位点。
研究路线图
核心内容
该研究以丹参毛状根为对象，探讨DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷对丹参酮生物合成的表观遗传调控机制。通过HPLC检测代谢物积累、qRT-PCR分析通路基因表达、重亚硫酸盐测序结合NGS解析CPS启动子甲基化状态，并利用PLANTPAN3.0预测去甲基化位点的转录因子结合特征。结果显示，50 μM及以上浓度的5-氮杂胞苷使五种丹参酮类成分含量较对照提高1.5至5倍，但毛状根生物量下降约四成，水溶性酚酸类物质亦明显减少。75 μM处理下，CPS表达总体上调约45%，基因组DNA甲基化水平在第7天较对照下降约84%。CPS启动子145个胞嘧啶中有51个发生去甲基化，其中-1412和-745位点甲基化水平分别降至23.07%和25.01%，共鉴定出36个潜在转录因子结合位点，NF-Y和MYB出现频率最高。研究首次揭示DNA甲基化通过改变CPS启动子及转录因子结合位点的甲基化状态参与丹参酮合成调控，为利用表观遗传策略促进药用植物活性成分积累提供了新思路。
创新点
首次报道DNA甲基化通过调节CPS启动子及转录因子结合位点参与丹参毛状根中丹参酮生物合成的机制；发现5-氮杂胞苷处理导致CPS启动子145个胞嘧啶中51个去甲基化，并鉴定出36个潜在转录因子结合位点，其中NF-Y和MYB位点富集。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Salvia miltiorrhiza hairy roots（丹参毛状根） | 甲羟戊酸（MVA）途径 | HMGR | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | MVA途径关键酶；5-氮杂胞苷处理后第7天和第14天表达分别上调90%和260% |
| Salvia miltiorrhiza hairy roots（丹参毛状根） | 甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径 | DXSI | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶I | 催化 | 第1天表达上调约35% |
| Salvia miltiorrhiza hairy roots（丹参毛状根） | 甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径 | DXSII | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶II | 催化 | 表达波动，第1天和第7天下降约50%，第14天上升约40% |
| Salvia miltiorrhiza hairy roots（丹参毛状根） | 甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径 | DXR | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 | 催化 | 第7天表达下降约40% |
| Salvia miltiorrhiza hairy roots（丹参毛状根） | 萜类前体/丹参酮骨架合成 | GGPPS | 香叶基香叶基二磷酸合酶 | 催化 | 表达变化剧烈：第1天下降44%，第4天上升50%，第7天下降约40% |
| Salvia miltiorrhiza hairy roots（丹参毛状根） | 丹参酮骨架合成 | CPS | 柯巴基二磷酸合酶 | 催化 | 关键酶；表达几乎在所有时间点上调约45%；其启动子区域甲基化模式被改变，51/145胞嘧啶去甲基化 |
| Salvia miltiorrhiza hairy roots（丹参毛状根） | 丹参酮骨架合成 | KSL | 贝壳杉烯合酶类似蛋白 | 催化 | 第7天下降约40%，第14天上升约40% |
| Salvia miltiorrhiza hairy roots（丹参毛状根） | 苯丙烷途径（酚酸合成） | PAL | 苯丙氨酸解氨酶 | 催化 | 第1天表达上调119%，第7天上调38% |
| Salvia miltiorrhiza hairy roots（丹参毛状根） | 苯丙烷途径（酚酸合成） | C4H | 肉桂酸4-羟化酶 | 催化 | 第1天表达上调18% |
| Salvia miltiorrhiza hairy roots（丹参毛状根） | 苯丙烷途径（酚酸合成） | 4CL1 | 4-香豆酸:CoA连接酶1 | 催化 | 第7天和第14天表达分别上调220%和120% |
| Salvia miltiorrhiza hairy roots（丹参毛状根） | 酪氨酸衍生途径（酚酸合成） | TAT | 酪氨酸氨基转移酶 | 催化 | 第4天表达下降60% |
| Salvia miltiorrhiza hairy roots（丹参毛状根） | 酪氨酸衍生途径（酚酸合成） | HPPR | 4-羟苯基丙酮酸还原酶 | 催化 | 第14天表达下降28% |
关键发现
- 5-氮杂胞苷浓度≥50 μM时，丹参酮类成分（二氢丹参酮I、丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA、丹参酮IIB）含量较对照提高1.5-5倍
- 12.5和25 μM处理使毛状根鲜重和干重下降约40%，≥50 μM时下降一半以上
- 水溶性成分迷迭香酸和丹酚酸B分别下降约50%和20%
- 75 μM处理下，PAL表达在第1天和第7天分别上调119%和38%，4CL1在第7天和第14天分别上调220%和120%，HMGR在第7天和第14天分别上调90%和260%，CPS总体上调约45%
- 基因组DNA甲基化水平在第7天较对照下降约84%，第14天回升并较对照高27%
- CPS启动子145个胞嘧啶中51个去甲基化，其中-1412、-745、-560、-554、-547位点甲基化水平分别降至23.07%、25.01%、40.92%、30.78%、26.14%
- 共鉴定36个去甲基化的潜在转录因子结合位点，NF-Y和MYB出现频率最高。
研究结论
5-氮杂胞苷通过抑制DNA甲基化，引起丹参毛状根中CPS启动子区域去甲基化，改变潜在转录因子（如NF-Y、MYB）结合位点的甲基化状态，从而上调丹参酮生物合成关键基因表达，最终提高丹参酮产量。该研究为通过表观遗传调控促进药用植物次生代谢产物积累提供了新策略，但去甲基化与转录因子结合亲和力之间的关系仍需进一步研究。