Multiplex CRISPR/Cas9-mediated knockout of the phytoene desaturase gene in Coffea canephora
- 作者
- Tatiane Casarin, Natália Chagas Freitas, Renan Terassi Pinto, Jean-Christophe Breitler, Leonardo Augusto Zebral Rodrigues, Pierre Marraccini, Hervé Etienne, Leandro Eugenio Cardamone Diniz, Alan Carvalho Andrade, Luciano Vilela Paiva
- 杂志
- Scientific Reports（2022）
- DOI
- 10.1038/s41598-022-21566-w
- 所属领域
- 基因工程
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解决的核心问题
验证CRISPR/Cas9系统在Coffea canephora（中粒咖啡）优良无性系克隆14中敲除八氢番茄红素脱氢酶基因（CcPDS）的有效性，并产生预期的白化表型，以加速咖啡育种进程。
研究策略
利用包含两个sgRNA（PDS3靶向外显子3，PDS5靶向外显子5）的多重二元载体pCOFEDIT-2，在C. canephora内源U6启动子驱动下表达sgRNA，通过农杆菌介导转化胚性愈伤组织，在低光照强度（约2 μmol m⁻² s⁻¹）和28°C共培养条件下再生体细胞胚和幼苗，通过PCR和Sanger测序验证Cas9插入及靶位点突变。
核心内容
本研究在优良中粒咖啡无性系克隆14中验证了多重CRISPR/Cas9系统敲除八氢番茄红素脱氢酶基因（CcPDS）的有效性。研究者构建了包含两个sgRNA（分别靶向外显子3和5）的二元载体pCOFEDIT-2，由咖啡内源U6启动子驱动sgRNA表达，通过农杆菌介导转化胚性愈伤组织，并在低光照（约2 μmol m⁻² s⁻¹）和28°C共培养条件下再生植株。结果显示，77%的再生幼苗在至少一个靶位点发生突变，其中50%呈纯合突变；靶2（外显子5）的编辑效率（61.5%）高于靶1（53.9%）。突变以1 bp插入和70 bp缺失为主，导致提前终止密码子并产生截短蛋白，最终获得完全白化、花斑和绿色三种表型。研究首次在咖啡中实现CcPDS基因的定向敲除并稳定产生白化表型，证实了该技术的高效性，为利用基因编辑改良咖啡的抗旱性、抗线虫能力和天然低咖啡因等重要性状提供了可行方案，有望将育种周期从25–30年缩短至约6年。
创新点
首次在C. canephora中通过多重CRISPR/Cas9敲除CcPDS基因获得完全白化表型；采用咖啡内源U6启动子驱动sgRNA；优化共培养温度和光照强度，显著提高突变效率（77%的再生幼苗发生突变）。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Coffea canephora clone 14 | 类胡萝卜素生物合成通路 | CcPDS (Cc04_g00540) | 八氢番茄红素脱氢酶 (phytoene desaturase) | 催化 | 靶基因，催化15-顺式八氢番茄红素脱氢生成β-胡萝卜素前体；敲除后产生白化表型。 |
| Coffea canephora clone 14 胚性愈伤组织 | — | SpCas9 | Cas9核酸内切酶 | 催化 | 由pCOFEDIT-2载体携带，在sgRNA引导下切割C cPDS靶位点，产生双链断裂。 |
关键发现
- 77%的再生幼苗在CcPDS基因至少一个靶位点发生突变，其中50%至少一个靶位点呈纯合突变
- 靶1（外显子3）突变率为53.9%（7/13），靶2（外显子5）突变率为61.5%（8/13）
- 获得完全白化、花斑和绿色三种表型。白化幼苗P5在靶1发生70 bp缺失，P7发生1 bp插入
- 这些突变导致提前终止密码子，产生截短蛋白。靶2（PDS5 sgRNA）的编辑效率更高，6个白化幼苗均在靶2发生突变且多为纯合。低光照强度（2 μmol m⁻² s⁻¹）和28°C共培养温度是获得白化植株的关键。
研究结论
CRISPR/Cas9系统能够高效地在C. canephora克隆14中诱导CcPDS基因靶向突变，并产生预期的白化表型，为利用基因编辑技术改良咖啡重要农艺性状（如抗旱、抗线虫及天然低咖啡因等）提供了可行方案，可将育种周期从25-30年缩短至约6年。