Engineering an acetoacetyl-CoA reductase from Cupriavidus necator toward NADH preference under physiological conditions
- 作者
- Karel Olavarria, Yared O. Pijman, Ricardo Cabrera, Mark C. M. van Loosdrecht, S. Aljoscha Wahl
- 杂志
- Scientific Reports（2022）
- DOI
- 10.1038/s41598-022-07663-w
- 所属领域
- 代谢工程/酶工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
将 Cupriavidus necator 的乙酰乙酰辅酶A还原酶 AAR (Cn1) 的辅因子偏好从 NADPH 改造为 NADH，使其能在生理条件下偏好 NADH，从而支持 PHB 作为厌氧发酵产品的 NADH 再氧化偶联。
研究策略
基于结构分析和同源建模，通过片段替换（源自 Candidatus Accumulibacter phosphatis 的 AAR (CAP)）和定点突变构建多种嵌合酶（Chimera 1-5），表达纯化后进行反应进程曲线动力学表征，并结合热力学-动力学模型评估生理条件下的通量能力和辅因子偏好。
研究路线图
核心内容
该研究通过酶工程改造Cupriavidus necator来源的乙酰乙酰辅酶A还原酶（AAR, Cn1），将其辅因子偏好由NADPH逆转为NADH，以支持厌氧条件下PHB合成与NADH再氧化的偶联。基于结构分析与同源建模，作者将Cn1与Candidatus Accumulibacter phosphatis来源的NADH偏好AAR进行片段替换，并结合定点突变构建了系列嵌合酶，经异源表达纯化后进行反应进程曲线动力学表征。所得嵌合酶Chimera 5的辅因子选择性比（(kcat/KM)^NADH/(kcat/KM)^NADPH）约为18，较亲本酶提高约160倍，其KM(NADH)为43微摩尔，而KM(NADPH)高达2787微摩尔。进一步采用热力学-动力学模型预测，在生理代谢物浓度下Chimera 5对NADH的偏好可达到NADPH的25至150倍，且其NADH驱动的通量足以支撑高达7 mmol/gCDW/h的PHB生产速率，高于文献报道的5.8 mmol/gCDW/h实测值。结果表明Chimera 5具备在E. coli和C. necator中功能性表达并维持野生型水平PHB积累通量的潜力，为氧限制条件下的PHB发酵提供了有效的酶工具。
创新点
获得了嵌合酶 Chimera 5，其选择性比 (kcat/KM)^NADH/(kcat/KM)^NADPH 约为 18，比亲本 AAR (Cn1) 高 160 倍；采用热力学-动力学方法预测生理条件下 Chimera 5 对 NADH 的偏好可达 25-150 倍，并证明其通量足以支撑 PHB 积累。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Cupriavidus necator | PHB 合成途径 | phaB1 | AAR Cn1（乙酰乙酰辅酶A还原酶） | 催化 | 野生型酶，偏好 NADPH，本研究改造的起点 |
| Escherichia coli | PHB 合成途径 | phaB Chimera5 | Chimera 5（工程乙酰乙酰辅酶A还原酶） | 催化 | 通过片段替换（AAR(Cn1) 的 33-46 位替换为 AAR(CAP) 相应序列）获得，选择性比约 17.72，偏好 NADH |
| Escherichia coli | PHB 合成途径 | phaB Chimera1 | Chimera 1（工程乙酰乙酰辅酶A还原酶） | 催化 | 前期构建的嵌合酶，将 37-41 位替换为 AAR(CAP) 序列，选择性比为 4.89，作为进一步改造的基础 |
| Escherichia coli | PHB 合成途径 | phaB Chimera2 | Chimera 2（工程乙酰乙酰辅酶A还原酶，P41G突变） | 催化 | 评估脯氨酸构象约束的作用，选择性比 2.50 |
| Escherichia coli | PHB 合成途径 | phaB Chimera3 | Chimera 3（工程乙酰乙酰辅酶A还原酶，F38A突变） | 催化 | 评估苯丙氨酸大侧链的作用，选择性比 1.33 |
| Escherichia coli | PHB 合成途径 | phaB Chimera4 | Chimera 4（工程乙酰乙酰辅酶A还原酶，F38E/K40Q突变） | 催化 | 评估电荷和氢键作用，选择性比 0.76，仍偏好 NADPH |
| Candidatus Accumulibacter phosphatis | PHB 合成途径 | phaB（CAP2UW1_3919） | AAR CAP（NADH偏好乙酰乙酰辅酶A还原酶） | 催化 | 天然 NADH 偏好酶，其片段被用于构建 Chimera 系列 |
| Cupriavidus necator | PHB 合成途径 | phaA | β-酮硫代酶 | 催化 | 催化乙酰辅酶A缩合为 AcAcCoA，反应热力学不利，与还原酶可能需底物通道 |
| Cupriavidus necator | PHB 合成途径 | phaC | PHB 合酶 | 催化 | 催化 3-羟基丁酰辅酶A聚合为 PHB |
关键发现
- AAR(Cn1) 的 (kcat/KM)^NADPH=0.118 μM/s，(kcat/KM)^NADH=0.013 μM/s，选择性比为
- 11；Chimera 5 的 kcat(NADH)=10.5 s^-1，KM(NADH)=43 μM，kcat(NADPH)=38.4 s^-1，KM(NADPH)=2787 μM，选择性比约为
- 72；热力学-动力学计算表明 Chimera 5 在生理条件下偏好 NADH 是 NADPH 的 25-150 倍；其 NADH 驱动的通量能力可支持高达 7 mmol/gCDW/h 的 PHB 生产速率（相比之下文献中实测 qPHB 为
- 8 mmol/gCDW/h）。
研究结论
Chimera 5 是源自 AAR(Cn1) 的具有 NADH 偏好的乙酰乙酰辅酶A还原酶，预期能在 E. coli 和 C. necator 中功能性表达，其活性足以支持与野生型相当的 PHB 积累通量，可用于氧限制条件下的 PHB 发酵生产。