Vanillin reduction in the biosynthetic pathway of capsaite, a non-pungent component of Capsicum fruits, is catalyzed by cinnamyl alcohol dehydrogenase
- 作者
- Kaori Sano, Yuya Uzawa, Itsuki Kaneshima, Saika Nakasato, Masashi Hashimoto, Yoshiyuki Tanaka, Sachie Nakatani, Kenji Kobata
- 单位
- Josai University; Kyoto University; Ajinomoto Co., Inc.
- 杂志
- Scientific Reports（2022）
- DOI
- 10.1038/s41598-022-16150-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定辣椒果实辣椒素酯生物合成途径中催化香草醛还原为香草醇的关键酶
研究策略
结合植物胎盘提取物体外酶活测定、特异性抑制剂（OHPAS和EDTA）抑制实验、qPCR基因表达分析、大肠杆菌异源表达重组CaCAD1并验证其活性，以及跨物种共线性分析推断途径演化顺序
研究路线图
核心内容
该研究鉴定了辣椒果实辣椒素酯生物合成途径中催化香草醛还原为香草醇的关键酶。通过辣椒胎座提取物体外酶活测定，发现成熟红果的香草醛还原活性显著高于未成熟绿果，24小时香草醇合成量约为绿果的10倍。特异性抑制剂OHPAS和EDTA能有效抑制该活性，提示肉桂醇脱氢酶参与此反应。进一步在大肠杆菌中异源表达辣椒CaCAD1基因，重组蛋白在30分钟内分别催化生成25.1 nmol肉桂醇、10.6 nmol松柏醇和6.4 nmol香草醇，且OHPAS呈浓度依赖性抑制其活性。qPCR显示CaCAD1在红果胎座中表达量高于绿果。跨物种共线性分析表明Pun1和CAD基因在茄科共同祖先中已存在，而pAMT为辣椒属特异获得，提示辣椒素酯合成途径可能先于辣椒素途径演化。该结果证明CaCAD1是辣椒素酯合成中的关键还原酶，在pAMT功能缺失时可补偿性将香草醛转化为香草醇，从而积累辣椒素酯。
创新点
首次证明肉桂醇脱氢酶（CAD）是辣椒素酯合成途径中负责香草醛还原的关键酶；通过共线性分析揭示辣椒素酯合成途径相关基因（Pun1和CAD）早于辣椒素合成关键基因pAMT被获得，提出辣椒素酯途径可能先于辣椒素途径演化
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Capsicum annuum (CH-19 Sweet) | 辣椒素酯/辣椒素生物合成途径 | CaCAD1 | 肉桂醇脱氢酶 (CAD) | 催化 | 催化香草醛还原为香草醇，参与辣椒素酯合成 |
| Capsicum annuum (CH-19 Sweet) | 辣椒素生物合成途径 | pAMT | 推定氨基转移酶 (pAMT) | 催化 | 催化香草醛转化为香草胺，辣椒素合成关键酶 |
| Capsicum annuum | 辣椒素/辣椒素酯生物合成途径 | Pun1 | 辣椒素合成酶 (Pun1) | 催化 | 催化香草胺/香草醇与支链脂肪酸缩合 |
| Escherichia coli BL21 Star (DE3) | 异源表达 | CaCAD1 | 重组CaCAD1 (rCaCAD1) | 催化 | 用于体外验证香草醛还原活性及抑制剂实验 |
关键发现
- 成熟红果胎盘提取物中香草醛还原活性比未成熟绿果高，24 h时香草醇合成量约为绿果的10倍
- 5 mM OHPAS抑制绿果提取物香草醛还原活性约90%，20 mM OHPAS抑制红果活性约80%
- EDTA以浓度依赖方式抑制绿果提取物活性
- 重组CaCAD1（5 μg）在30 min内分别催化生成25.1 nmol肉桂醇、10.6 nmol松柏醇和6.4 nmol香草醇
- 25 mg重组CaCAD1蛋白从250 mL大肠杆菌培养物中获得
- OHPAS呈浓度依赖性抑制rCaCAD1活性（5 mM抑制至60%，20 mM抑制至20%）
- CaCAD1在红果胎座中表达量高于绿果
- 共线性分析显示pAMT为辣椒属特异获得，Pun1和CAD在茄科共同祖先中已存在
研究结论
肉桂醇脱氢酶（CaCAD1）能够催化香草醛还原为香草醇，是辣椒素酯生物合成途径中的关键酶；在pAMT功能缺失时，CAD可补偿性地将香草醛转化为香草醇，从而积累辣椒素酯；比较基因组分析表明辣椒素酯合成途径可能先于辣椒素合成途径在辣椒属中建立