Hormonal control of promoter activities of Cannabis sativa prenyltransferase 1 and 4 and salicylic acid mediated regulation of cannabinoid biosynthesis
- 作者
- Lauren B. Sands, Samuel R. Haiden, Yi Ma, Gerald A. Berkowitz
- 杂志
- Scientific Reports（2023）
- DOI
- 10.1038/s41598-023-35303-4
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
解析大麻素生物合成限速酶CsPT1和CsPT4基因启动子的激素调控机制，以及水杨酸对大麻素合成途径基因表达的调节作用。
研究策略
结合生物信息学启动子顺式元件分析、GUS报告基因定位、双荧光素酶报告系统验证、定点突变、以及水杨酸处理大麻植株结合实时定量PCR分析，阐明激素对CsPT1和CsPT4启动子及大麻素合成基因表达的调控。
核心内容
该研究系统解析了大麻中芳香族异戊烯转移酶CsPT1和CsPT4基因启动子的激素调控机制，并考察了水杨酸对大麻素生物合成途径的调节作用。研究者结合生物信息学顺式元件分析、GUS报告基因定位、双荧光素酶报告系统及定点突变等手段，发现CsPT1与CsPT4启动子含有多种激素响应元件，其中CsPT4启动子在腺毛中活性较强，对细胞分裂素、脱落酸、赤霉素、乙烯及水杨酸均有显著响应；通过定点突变证实CsPT4启动子中的水杨酸响应元件为真实功能性顺式元件。进一步以1 mM水杨酸根灌处理大麻植株72小时后，限速酶基因CsPT4的表达较对照上调约100倍，四酮合酶在48小时表达达到峰值，而叶面喷施甲基水杨酸使大麻二酚酸含量增加47%。酶动力学分析显示CsPT4对底物橄榄醇酸的Km为6.72 μM，远低于CsPT1的60 mM，提示CsPT4是更可能的限速催化酶。该工作揭示了水杨酸通过激活CsPT4启动子正向调控大麻素合成的分子机制，为大麻素产量的遗传改良与代谢工程提供了重要理论依据。
创新点
首次系统研究CsPT1和CsPT4启动子的激素响应元件及其功能；通过定点突变证实CsPT4启动子中的SA响应元件为真实顺式元件；发现SA处理可大幅上调限速酶CsPT4表达约100倍；揭示了激素信号与大麻素生物合成的关联。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Cannabis sativa | 大麻素生物合成途径 | CsPT4 | 芳香族异戊烯转移酶4 (CsPT4) | 催化 | 催化OA和GPP生成CBGA，对OA的Km为6.72 μM |
| Cannabis sativa | 大麻素生物合成途径 | CsPT1 | 芳香族异戊烯转移酶1 (CsPT1) | 催化 | 催化OA和GPP生成CBGA，对OA的Km为60 mM |
| Cannabis sativa | 聚酮代谢途径 | TKS | 四酮合酶 | 催化 | 与OAC共同作用从己酰-CoA和丙二酰-CoA合成橄榄醇酸 |
| Cannabis sativa | 聚酮代谢途径 | OAC | 橄榄醇酸环化酶 | 催化 | 与TKS共同作用合成橄榄醇酸 |
| Cannabis sativa | MEP途径 | GPPS ssu | 牻牛儿基焦磷酸合酶小亚基 | 催化 | 合成GPP，为大麻素和萜烯提供前体 |
| Cannabis sativa | 大麻素生物合成途径 | CBDAS | 大麻二酚酸合酶 | 催化 | 催化CBGA转化为CBDA |
| 拟南芥原生质体 | 大麻素生物合成途径（启动子报告检测） | CsPT4 | — | 调控 | CsPT4启动子驱动荧光素酶报告基因，验证激素响应，含SA响应元件经点突变证实具有功能 |
| 拟南芥原生质体 | 大麻素生物合成途径（启动子报告检测） | CsPT1 | — | 调控 | CsPT1启动子驱动荧光素酶报告基因，对NAA、ABA和SA有响应 |
关键发现
- CsPT1和CsPT4在雌花中高表达，CsPT4启动子活性在腺毛中较强
- CsPT4启动子含3个细胞分裂素、1个SA、1个GA、1个乙烯和1个ABA响应元件，CsPT1启动子含5个GA、2个SA、3个ABA和3个生长素响应元件
- 双荧光素酶实验显示CsPT4启动子对ZR、ACC、ABA、GA和SA均有显著响应，CsPT1启动子对NAA、ABA和SA响应
- 突变CsPT4启动子中的SA元件后其对SA不再响应
- 1 mM SA根灌处理72 h后，CsPT4表达较对照上调约100倍，TKS在48 h表达达峰
- MeSA叶面喷施使CBDA含量增加47%（无显著差异）
- CsPT1对OA的Km为60 mM，CsPT4对OA的Km为6.72 μM。
研究结论
激素（尤其是水杨酸）通过调控CsPT1和CsPT4等基因的启动子活性参与大麻素生物合成的调节，CsPT4是更可能的限速催化酶；SA可正向调控大麻素途径多个基因的表达，为大麻素产量的遗传改良和代谢工程提供了理论基础。