Deletion of genes linked to the C1-fixing gene cluster affects growth, by-products, and proteome of Clostridium autoethanogenum
- 作者
- Ugochi Jennifer Nwaokorie, Kristina Reinmets, Lorena Azevedo de Lima, Pratik Rajendra Pawar, Kurshedaktar Majibullah Shaikh, Audrey Harris, Michael Kopke, Kaspar Valpepea
- 单位
- ERA Chair in Gas Fermentation Technologies, Institute of Technology, University of Tartu, Tartu, Estonia; LanzaTech Inc., Skokie, IL, United States
- 杂志
- Frontiers in Bioengineering and Biotechnology（2023）
- DOI
- 10.3389/fbioe.2023.1167892
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
揭示与C1固定基因簇相邻但功能未知的基因hp（LABRINI_07945）和nbp（LABRINI_07950）在模式产乙酸菌Clostridium autoethanogenum中的生理功能，及其对自养生长、副产物生成和蛋白质组的影响。
研究策略
利用CRISPR/nCas9基因编辑系统在C. autoethanogenum中分别敲除hp和nbp基因，在异养和自养批式培养以及自养恒化器连续培养中表征突变株的生长和产物谱，并通过蛋白质组学分析基因缺失对蛋白表达的影响。
核心内容
该研究利用CRISPR/nCas9基因编辑系统，在模式产乙酸菌Clostridium autoethanogenum中分别敲除了与C1固定基因簇相邻但功能未知的hp（LABRINI_07945）和nbp（LABRINI_07950）基因，通过异养与自养批式培养、自养恒化器连续培养及蛋白质组学分析，系统解析了这两个基因的生理功能。结果显示，在丰富培养基中两突变株在果糖和合成气上的最大比生长速率均显著低于野生型，Δhp分别降低21%和37%，Δnbp分别降低34%和26%；但在最小培养基自养条件下无显著差异。丰富培养基自养批式培养中，Δhp的乙酸产量达550±45 mmol/gDCW，为野生型的5倍以上；Δnbp的乙醇产量比野生型低33%，2,3-BDO产量高44%。恒化器培养中，两突变株的CO摄取速率比野生型低5%–8%，碳流分析显示更多碳流向生物量和CO2而非乙醇和乙酸。蛋白质组学揭示两突变株分别有93和77个差异表达蛋白，其中C1固定相关蛋白AcsE/AcsD上调1.5–1.6倍、AcsB和CooS1下调，乙醇合成相关蛋白如Adh4上调3.3倍、AdhE1上调1.7–4.2倍。研究表明hp和nbp对自养生长和产物分配具有重要调控作用，为优化气体发酵细胞工厂提供了新靶点。
创新点
['首次对C1固定基因簇邻近的hp和nbp基因进行靶向单基因敲除，并系统表征其表型', '揭示了hp和nbp基因同时影响自养生长的生长速率、副产物分布以及C1固定和乙醇合成途径蛋白的表达', '为工业相关产乙酸菌的遗传改造提供了新的工程靶点']
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clostridium autoethanogenum (菌株LABrini) | Wood-Ljungdahl通路 | hp (LABRINI_07945) | hypothetical protein (Hp) | 调控 | 功能未明，邻近C1固定基因簇；敲除导致丰富培养基中μmax显著降低（果糖-21%，合成气-37%），乙酸产量提高>5倍，并影响C1固定和乙醇合成蛋白表达 |
| Clostridium autoethanogenum (菌株LABrini) | Wood-Ljungdahl通路 | nbp (LABRINI_07950) | CooT family nickel binding protein (Nbp) | 转运 | 注释为镍结合蛋白；敲除导致丰富培养基中μmax显著降低（果糖-34%，合成气-26%），乙醇合成降低，并影响C1固定蛋白表达 |
| Clostridium autoethanogenum (菌株LABrini) | Wood-Ljungdahl通路 | acsB (LABRINI_07965) | Acetyl-CoA synthase (ACS) | 催化 | CODH/ACS复合物核心亚基；在Δhp和Δnbp中表达下调（-1.5倍和-1.8倍） |
| Clostridium autoethanogenum (菌株LABrini) | Wood-Ljungdahl通路 | acsD (LABRINI_07980) 和 acsE (LABRINI_07970) | Correnoid iron sulfur protein part2 (AcsD) 和 Methyltransferase for CODH (AcsE) | 催化 | 为CODH/ACS供给甲基；在两个突变株中表达上调（1.5–1.6倍） |
| Clostridium autoethanogenum (菌株LABrini) | Wood-Ljungdahl通路 | cooS1 (LABRINI_15015) | Carbon-monoxide dehydrogenase CooS1 | 催化 | 最丰富的CODH；在Δhp和Δnbp中表达下调（-1.5倍和-1.8倍） |
| Clostridium autoethanogenum (菌株LABrini) | 乙醇合成通路 | adh4 (LABRINI_09125) 及其他adh基因 | Iron-containing alcohol dehydrogenase (Adh4等) | 催化 | Adh4在Δhp和Δnbp中分别上调3.3倍和3.4倍，与乙醇产量下降并不一致，提示转录后调控 |
| Clostridium autoethanogenum (菌株LABrini) | 乙醇合成通路 | aor1 (LABRINI_00445) 和 aor2 (LABRINI_00495) | Aldehyde ferredoxin oxidoreductase (AOR1/AOR2) | 催化 | AOR2在Δhp和Δnbp中分别上调2.1倍和2.8倍，参与乙醇合成并偶联ATP生成 |
| Clostridium autoethanogenum (菌株LABrini) | 乙醇合成通路 | adhE1 (LABRINI_18700) | Bifunctional acetaldehyde-CoA/alcohol dehydrogenase AdhE1 | 催化 | 在Δhp和Δnbp中分别上调1.7倍和4.2倍 |
关键发现
- 在丰富培养基中，Δhp和Δnbp在果糖和合成气上的最大比生长速率（μmax）均显著低于野生型LABrini：Δhp为0.08 h⁻¹（果糖）和0.05 h⁻¹（合成气），Δnbp为0.07 h⁻¹（果糖）和0.06 h⁻¹（合成气），野生型为0.10 h⁻¹（果糖）和0.08 h⁻¹（合成气），分别降低21%/37%和34%/26%。在无酵母提取物的最小培养基自养批式培养中，三株菌μmax均为0.08 h⁻¹，无显著差异。丰富培养基自养批式培养中，Δhp的乙酸产量为550±45 mmol/gDCW，是野生型（92±7 mmol/gDCW）的5倍以上
- Δnbp的乙酸产量为130±0.2 mmol/gDCW（高41%），2,3-BDO产量为10±1 mmol/gDCW（高44%），乙醇产量为65±8 mmol/gDCW（低33%）。在最小培养基中，Δnbp的乙醇产量为9±6 mmol/gDCW，比野生型（65±1 mmol/gDCW）低86%。恒化器连续培养中，Δhp和Δnbp的特异性乙酸和乙醇生产速率均低于野生型
- CO摄取速率分别为805±19和830±15 mmol/gDCW/day，比野生型（873±19）低8%和5%，但H2摄取和CO2产生速率无显著差异
- 碳流分析显示两突变株将更多碳分配给生物量和CO2，而流向乙醇和乙酸的碳减少。蛋白质组学分析鉴定出Δhp和Δnbp分别有93和77个差异表达蛋白（FC>1.5, q<0.05），其中C1固定相关蛋白AcsE和AcsD表达上调（1.5–1.6倍），AcsB和CooS1表达下调（-1.5至-1.8倍），乙醇合成相关蛋白如Adh4（LABRINI_09125）上调3.3倍，AOR2上调2.1–2.8倍，AdhE1上调1.7–4.2倍。
研究结论
hp和nbp基因对C. autoethanogenum的自养生长和产物分配具有重要调控作用，其缺失导致生长缺陷、副产物谱改变及C1固定和乙醇合成途径蛋白表达异常。研究证明了CRISPR/nCas9可有效用于该产乙酸菌的基因编辑，为深入理解基因型-表型关系及优化气体发酵细胞工厂提供了新靶点。