Critical enzymes for biosynthesis of cucurbitacin derivatives in watermelon and their biological significance
- 作者
- Young-Cheon Kim, Daeun Choi, Ahra Cha, Yeong-Geun Lee, Nam-In Baek, Suman Rimal, Jiun Sang, Youngseok Lee, Sanghyeob Lee
- 杂志
- Communications Biology（2020）
- DOI
- 10.1038/s42003-020-01170-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析西瓜中参与葫芦素衍生物生物合成的关键酶（乙酰转移酶ACTs和UDP-葡萄糖基转移酶UGT）的功能，阐明其如何通过催化乙酰化和糖基化修饰葫芦素骨架，生成多样化的葫芦素衍生物，并探讨其在植物胁迫响应和昆虫取食行为中的生物学意义。
研究策略
利用RNA-seq比较转录组分析筛选候选基因，通过异源重组蛋白表达和体外酶活测定，结合LC-MS和NMR进行产物结构鉴定；采用植物瞬时表达和损伤处理研究体内积累；使用果蝇味觉电生理检测对昆虫行为的影响。
核心内容
本研究系统解析了西瓜中葫芦素衍生物生物合成的四个关键修饰酶。通过比较转录组筛选候选基因，利用异源重组表达和体外酶活测定，结合LC-MS和NMR鉴定产物结构，首次证实ACT3（Cla022713）特异性催化葫芦素C16位羟基乙酰化，合成两个新化合物16-O-乙酰葫芦素D和I；ACT1（Cla007081）兼具C25乙酰化与去乙酰化双重活性，可逆转化CuD/CuI与CuB/CuE；UGT74F2（Cla004392）仅对葫芦素E具有底物特异性的葡萄糖基化活性。酶动力学显示ACT3对CuE-Glu催化效率最高（kcat/Km=21.21×10² M⁻¹s⁻¹），对CuE最低。损伤处理2小时后16-O-乙酰CuE在西瓜叶片显著积累并持续至少18小时，瞬时过表达ACT3可增加其含量。果蝇味觉电生理检测发现0.01 mM的16-O-乙酰CuB比CuB诱导更强的苦味神经元放电。这些结果揭示了乙酰化和糖基化修饰在增加葫芦素结构多样性、植物胁迫响应及调控昆虫取食行为中的潜在功能，为理解植物化学防御的分子机制提供了新视角。
创新点
首次鉴定出ACT3（Cla022713）特异性催化葫芦素C16-羟基乙酰化，并合成两个新化合物16-O-乙酰葫芦素D和16-O-乙酰葫芦素I；发现ACT1（Cla007081）兼具C25乙酰化和去乙酰化双重活性；证实UGT74F2（Cla004392）对葫芦素E具有底物特异性的葡萄糖基化活性；揭示这些修饰酶在损伤诱导的葫芦素积累和昆虫味觉感知中的潜在功能。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli BL21(DE3) | 葫芦素衍生物生物合成 | Cla022713 | ACT3 | 催化 | 催化葫芦素C16-羟基乙酰化，底物包括CuB、CuD、CuI、CuE和CuE-Glu，生成相应的16-O-乙酰衍生物 |
| E. coli BL21(DE3) | 葫芦素衍生物生物合成 | Cla007081 | ACT1 | 催化 | 具有C25-乙酰转移酶和脱乙酰酶双重活性，可乙酰化CuD和CuI生成CuB和CuE，也可去乙酰化CuB和CuE生成CuD和CuI，并对CuE-Glu和16-O-乙酰CuE-Glu有去乙酰化活性 |
| E. coli BL21(DE3) | 葫芦素衍生物生物合成 | Cla008353 | ACT2 | 催化 | 对葫芦素底物无乙酰化活性，但能乙酰化蜕皮激素和皮质醇 |
| E. coli BL21(DE3) | 葫芦素衍生物生物合成 | Cla004392 | UGT74F2 | 催化 | UDP-葡萄糖基转移酶，特异催化CuE的糖基化生成CuE-2-O-葡萄糖苷 |
关键发现
- ACT3对CuE-Glu具有最高催化效率（kcat/Km=21.21×10^2 M^-1 s^-1，kcat=2.47×10^-2 s^-1，Vmax=20.56 nmol/min/mg），对CuE最低（kcat/Km=7.21×10^2 M^-1 s^-1）
- ACT1能将CuD和CuI的C25羟基乙酰化为CuB和CuE，同时也能去乙酰化CuB和CuE的C25乙酰基，生成CuD和CuI
- UGT74F2仅糖基化CuE生成CuE-Glu，对CuB、CuD、CuI无活性
- 损伤处理2小时后16-O-乙酰CuE在西瓜叶片中显著积累并持续至少18小时
- 瞬时过表达ACT3显著增加16-O-乙酰CuE含量
- 果蝇电生理显示0.01 mM的16-O-乙酰CuB比CuB诱导更强的苦味神经元放电
- ACT1/2/3均能乙酰化蜕皮激素和皮质醇。
研究结论
本研究系统鉴定了西瓜中三个乙酰转移酶（ACT1、ACT2、ACT3）和一个UDP-葡萄糖基转移酶（UGT74F2）在葫芦素衍生物生物合成中的功能。ACT3催化C16-乙酰化生成新的葫芦素衍生物，ACT1具有C25乙酰化/去乙酰化双重功能，UGT74F2特异糖基化CuE。这些酶通过修饰葫芦素骨架的侧链，显著增加葫芦素的结构多样性，并在机械损伤时特异性积累16-O-乙酰CuE，暗示其在植物防御中发挥重要作用。此外，乙酰化修饰可能改变葫芦素对昆虫的味觉刺激，影响植食性昆虫的行为。