Bioinformatics-aided identification, characterization and applications of mushroom linalool synthases
- 作者
- Congqiang Zhang, Xixian Chen, Raphael Tze Chuen Lee, Rehka T, Sebastian Maurer-Stroh, Martin Rühl
- 杂志
- Communications Biology（2021）
- DOI
- 10.1038/s42003-021-01715-z
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
植物芳樟醇合酶在微生物宿主中表达时活性低，缺乏高活性、高特异性的芳樟醇合酶，限制了芳樟醇的微生物合成效率与选择性。
研究策略
结合BLAST搜索、全序列比对和预测活性位点比对等生物信息学方法，从真菌基因组中挖掘候选芳樟醇/橙花叔醇合酶，并通过实验验证、体外动力学表征、体内产量比较、结构建模和定点突变等手段进行功能研究与优化。
核心内容
本研究通过多层次的生物信息学策略，从伞菌纲真菌基因组中挖掘并鉴定出五个芳樟醇合酶：四个双功能芳樟醇/橙花叔醇合酶（Aa.LNS、Ap.LNS、Gm.LNS、Hs.LNS）和一个高特异性单功能芳樟醇合酶Ap.LS。在大肠杆菌中利用葡萄糖和甲羟戊酸途径生产时，Ap.LS产量达到381.2 mg/L，是细菌来源Sc.LNS的44倍、植物来源Cb.LS的287倍，且在TB培养基中进一步提升至601.2 mg/L；该酶产生对映纯(R)-芳樟醇。体外动力学表征显示Ap.LS对GPP的Km为3.8±0.7 μM，kcat/Km为1.6 min⁻¹ μM⁻¹，为已知芳樟醇合酶中最高，且对FPP无活性。通过结构比较和定点突变实验，确认了Ap.LS选择性关键氨基酸残基：A59S-L60M双突变引入约2%橙花叔醇产物，进一步引入V61I使橙花叔醇比例增至约40%，而Ap.LNS的5-6个突变可使芳樟醇比例从11%提升至86%。分子对接显示Ap.LS与GPP形成9个疏水相互作用。该研究证明真菌Ap.LS是微生物合成芳樟醇的理想催化剂，建立的生物信息学工作流为萜类合酶的功能挖掘与理性设计提供了有效途径。
创新点
['从多种伞菌纲真菌中鉴定出四个双功能芳樟醇/橙花叔醇合酶和一个高特异性单功能芳樟醇合酶Ap.LS', '发现Ap.LS在大肠杆菌中生产芳樟醇的产量远高于细菌和植物来源的合酶，且产生对映纯(R)-芳樟醇', '通过结构比较和突变实验确定了Ap.LS选择性的关键氨基酸残基']
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | Ap.LS (AgredpI_689675) | 芳樟醇合酶 | 催化 | 来自Agrocybe pediades，高特异性单功能酶，仅利用GPP产生对映纯(R)-芳樟醇 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | Aa.LNS (AAE3_109435) | 芳樟醇/橙花叔醇合酶 | 催化 | 来自Agrocybe aegerita（现Cyclocybe aegerita），双功能，既利用GPP也利用FPP |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | Ap.LNS (AgredpI_689671) | 芳樟醇/橙花叔醇合酶 | 催化 | 来自Agrocybe pediades，双功能 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | Gm.LNS (Galma_223690) | 芳樟醇/橙花叔醇合酶 | 催化 | 来自Galerina marginata，双功能 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | Hs.LNS (Hypsu1_148385) | 芳樟醇/橙花叔醇合酶 | 催化 | 来自Hypholoma sublateritium，双功能，但表达量低 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | Sc.LNS (D5SL78) | 芳樟醇/橙花叔醇合酶 | 催化 | 来自Streptomyces clavuligerus，细菌来源，偏好FPP，主要产橙花叔醇 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | Cb.LS (Q96376) | 芳樟醇合酶 | 催化 | 来自Clarkia breweri，植物来源，活性低 |
| Escherichia coli | MEP途径 | dxs, idi, ispA_S80F | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶、异戊烯基二磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合酶突变体 | 催化 | 用于增强GPP前体供给 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | — | 甲羟戊酸途径酶 | 催化 | p15A载体携带完整甲羟戊酸途径基因，用于增强IPP/DMAPP供给 |
关键发现
- 通过生物信息学预测和实验验证，鉴定出四个双功能芳樟醇/橙花叔醇合酶（Aa.LNS、Ap.LNS、Gm.LNS、Hs.LNS）和一个单功能芳樟醇合酶Ap.LS。Ap.LS在大肠杆菌中利用葡萄糖生产对映纯(R)-芳樟醇，产量达381.2 mg/L，是细菌Sc.LNS（8.7 mg/L）的44倍、植物Cb.LS（1.3 mg/L）的287倍
- 在TB培养基中产量达601.2 mg/L，较之前报道提高65%。体外动力学显示Ap.LS对GPP的Km=3.8±0.7 μM，kcat=6.0±0.3 min⁻¹，kcat/Km=1.6 min⁻¹ μM⁻¹，为已知芳樟醇合酶中最高
- Ap.LS对FPP无活性。Aa.LNS对FPP的Km=9.0±2.3 μM（kcat=3.3±0.3 min⁻¹），对GPP的Km=6.7±4.6 μM（kcat=0.5±0.1 min⁻¹）。突变实验表明，Ap.LS双突变A59S-L60M使其产生约2%橙花叔醇，进一步引入V61I使橙花叔醇比例增至约40%且芳樟醇产量下降45%
- Ap.LNS的5-6个突变可使芳樟醇比例从11%提高到86%。结构分析显示Ap.LS与GPP有9个疏水相互作用，结合亲和力为-7.6 kcal/mol。
研究结论
真菌来源的Ap.LS具有高活性、高选择性，是微生物合成芳樟醇的理想催化剂。本研究建立的多层次生物信息学工作流可有效挖掘未知功能酶，结构分析和突变实验揭示了芳樟醇合酶选择性的关键决定因素，为萜类合酶的理性设计和代谢工程应用奠定了基础。