Carotenoid binding in Gloeobacteria rhodopsin provides insights into divergent evolution of xanthorhodopsin types
- 作者
- Kimleng Chuon, Jin-gon Shim, Kun-Wook Kang, Shin-Gyu Cho, Chenda Hour, Seanghun Meas, Ji-Hyun Kim, Ahreum Choi, Kwang-Hwan Jung
- 杂志
- Communications Biology（2022）
- DOI
- 10.1038/s42003-022-03429-2
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
阐明微生物视紫红质中类胡萝卜素结合的分子机制，以及该类胡萝卜素结合功能在进化中如何丢失或替代。
研究策略
以Gloeobacter violaceus的xanthorhodopsin（GR）为模型，通过共表达角黄素（canthaxanthin）和定点突变，结合光谱分析、分子对接、进化分析等方法，解析类胡萝卜素-视紫红质相互作用的关键氨基酸基序。
研究路线图
核心内容
该研究以Gloeobacter violaceus的xanthorhodopsin（GR）为模型，通过在大肠杆菌中共表达角黄素并进行定点突变，结合光谱分析、分子对接与进化分析，系统解析了类胡萝卜素与视紫红质结合的分子机制。研究首次鉴定了类胡萝卜素锁定基序（CLM）、对齐基序（CAM）和颜色调谐丝氨酸（CTS）三个关键功能基序，并发现单个G178W突变可完全阻断类胡萝卜素结合却模拟其功能增益。关键突变导致结合率显著下降，如F185G约为37%，T179G/T182G/F185G组合突变降至约5%，而野生型结合率约87%；S181G使最大吸收蓝移14 nm，S221G则红移14 nm。分子对接自由能为-5.34 kcal/mol，Kd为121.15 μM。G178W突变株相比野生型及类胡萝卜素结合株表现出更高的pH稳定性和质子泵活性，且质子泵活性比GR野生型高约2.62倍。进化分析显示G178在150个同源序列中24%被Trp替换，S181的16.66%被Ala替换，提示了从类胡萝卜素结合型向非结合型视紫红质的趋异进化路径。该研究阐明了类胡萝卜素结合的关键氨基酸基础，并通过单突变替代其功能，为微生物视紫红质的蛋白质工程改造提供了新思路。
创新点
首次鉴定了类胡萝卜素锁定基序（CLM）、类胡萝卜素对齐基序（CAM）和颜色调谐丝氨酸（CTS）三个功能基序；发现单个突变G178W可完全阻断类胡萝卜素结合但模拟其功能增益；揭示了视紫红质从类胡萝卜素结合向非结合型（如proteorhodopsin）的趋异进化路径。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21 | 类胡萝卜素生物合成 | ctrW (alr3189) | β-胡萝卜素酮化酶 (CrtW) | 催化 | 来自Nostoc sp. PCC7120，催化生成角黄素（canthaxanthin） |
| Escherichia coli BL21 | 无（外源添加视黄醛） | GR (gl10198) | Gloeobacter rhodopsin (GR) | 转运 | 光驱动质子泵，与角黄素共表达形成双发色团复合物 |
| Escherichia coli BL21 | 类胡萝卜素生物合成 | 无（经修饰的pAC-BETA载体） | 角黄素 (canthaxanthin) | 能量供给 | 作为光捕获天线，与GR的类胡萝卜素结合位点结合 |
| Gloeobacter violaceus PCC 7421 | 类胡萝卜素生物合成 | GR (gl10198) | Gloeobacter rhodopsin (GR) | 转运 | 天然宿主，体内结合海胆酮（echinone） |
| Escherichia coli BL21 | 无 | GR突变体 (G178W, T179G, S181G, F185G, T179G/T182G, T179G/T182G/F185G, S221G, P226G, I227G, P226G/I227G) | GR突变蛋白 | 转运 | 用于鉴定类胡萝卜素结合关键残基 |
| Pyrocystis lunula | 无 | Pyrocystis lunula rhodopsin 基因 | Pyro-rhodopsin | 转运 | 海洋甲藻视紫红质，与GR比较进化关系 |
| Salinibacter ruber | 无 | xanthorhodopsin 基因 | Xanthorhodopsin (XR) | 转运 | 用于结构比对，难以异源表达 |
关键发现
- GR与角黄素共表达获得1:1的结合比；G178W突变完全抑制类胡萝卜素结合；关键突变导致结合率下降：F185G约37%、T179G约41%、T179G/T182G约19%、T179G/T182G/F185G约5%，而野生型约87%；螺旋F突变S221G、P226G、I227G、P226G/I227G结合率分别约69%、48%、42%、29%；野生型20分钟内结合约88%，时间常数2.1分钟；S181G使最大吸收蓝移14 nm，S221G红移14 nm；GR结合类胡萝卜素后最大吸收485 nm，视网膜最大吸收545 nm，结合后视网膜吸收红移7 nm；分子对接自由能-5.34 kcal/mol，Kd
- 15 μM；Pyrocystis lunula rhodopsin最大吸收515 nm，质子泵活性比GR野生型高约2.62倍；G178W突变株比GR野生型和类胡萝卜素结合株具有更高pH稳定性和质子泵活性；进化分析显示G178在150个同源序列中24%被Trp、2%被Phe替换，S181
- 66%被Ala、0.66%被Gly替换。
研究结论
本研究确定了类胡萝卜素结合的三个关键基序（CLM、CAM、CTS），证明G178W单突变可替代类胡萝卜素的功能，并提出了xanthorhodopsin型视紫红质向proteorhodopsin型（无类胡萝卜素结合）的进化分化路径，为微生物视紫红质的蛋白质工程改造提供了新思路。